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关注并星标CPHI制药在线 上文中（《褪黑素促进骨再生作用机制的研究进展（上）》），我们介绍了褪黑素促进骨再生作用的抗炎和抗氧化作用以及在成骨细胞分化和自噬的作用，本文继续介绍褪黑素与成骨细胞凋亡和铁死亡的关系以及对破骨细胞的作用机制和促进血管生成的作用。 ③褪黑素与成骨细胞凋亡 研究表明，褪黑素对成骨细胞凋亡的影响具有两面性，且与褪黑素浓度密切相关。实验发现使用高糖培养成骨细胞48h后细胞的凋亡率为40.8%，凋亡蛋白cleaved caspase 3的表达升高，而加入褪黑素后细胞凋亡率为28.3%，cleaved caspase 3的表达降低。这与另外两项研究实验结果相似，褪黑素干预后成骨细胞早期凋亡率、总死亡率以及Bax、caspase-3等凋亡相关蛋白的表达明显降低。研究表明，褪黑素可以缓解并改善成骨细胞的凋亡水平，进一步分析发现其与抑制成骨细胞氧化应激密切相关。褪黑素干预后可使枸橼酸铁铵和铝作用成骨细胞造成ROS蓄积的结果得到缓解，使 ROS水平降低。研究表明褪黑素可使核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）途径相关蛋白Nrf-2及HO-1表达进一步的增加。Nrf-2是人抗氧化反应元件（ARE）的正向调节因子，Nrf-2通路的激活可以调节细胞内大量抗氧化基因产物的表达水平，并降低氧化应激水平，从而使凋亡水平降低，说明褪黑素抑制成骨细胞的凋亡水平，可能与通过Nrf-2途径抑制成骨细胞的氧化应激水平有关。 另有研究表明使用高浓度褪黑素干预成骨细胞，介导内质网应激（ERS）、调节STIM1，导致Septin4、Septin7表达增加以及细胞膜钙升高，成骨细胞过量表达Septin4，可使细胞骨架破坏、细胞形态改变和细胞数量减少。这可能与细胞膜钙升高，通过ERK途径诱导成骨细胞都会使成骨细胞的凋亡明显增加有关。 ④褪黑素与成骨细胞铁死亡 铁死亡是一种铁依赖性的细胞死亡方式，是由于细胞内脂质过氧化、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）抗氧化系统失调以及铁超负荷所致，主要特征是细胞内活性氧的堆积和线粒体形态、膜电位的改变。多项研究表明，褪黑素对成骨细胞的铁死亡具有抑制作用，且此作用与褪黑素改善成骨细胞氧化应激以及铁自噬密切相关。 首先，褪黑素通过调节Nrf2/HO-1、Wnt以及PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k信号通路使成骨细胞氧化应激水平降低，从而抑制铁死亡。研究表明褪黑素可以使高糖诱导成骨细胞发生铁死亡导致的GPX4和胱氨酸⁃谷氨酸逆向转运蛋白（SLC7A11）表达下调得到逆转，从而抑制成骨细胞的铁死亡。同时研究人员检测核因子红细胞2相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶⁃1（HO-1）的表达水平，结果显示在褪黑素组中的表达水平明显高于高糖组，而在使用Nrf2⁃SiRNA干扰后，褪黑素对成骨细胞铁死亡的改善作用则受到明显抑制，这说明其中Nrf2/HO-1通路起着重要作用。值得注意的是，实验发现铁剂量依赖性下调Wnt靶基因以及PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k 信号通路相关基因的转录与表达，抑制其信号传导，生成ROS和脂质过氧化产物（LPO）。在使用褪黑素后可逆转铁抑制的典型 Wnt及PI3K/AKT/GSK-3β /P70S6k 信号转导，减少ROS和LPO的产生，改善氧化应激，预防铁死亡，恢复铁死亡对成骨细胞分化的抑制作用。 其次，褪黑素可以调节miR-550a-3p/ELAVL1轴，改善铁自噬来抑制成骨细胞的铁死亡。ELAV样蛋白1 （ELAVL1） 是一种RNA结合蛋白，能够介导铁自噬，使铁蛋白降解，氧化应激水平升高，从而引起铁死亡。 通过双荧光素酶检测发现miR-550a-3p能够靶向作用于ELAVL1，褪黑素干预高糖培养成骨细胞后miR-550a-3p表达上调，调控ELAVL1表达下调，减少铁自噬的发生，从而使铁死亡得到抑制。根据上述实验结果可知，褪黑素显著降低成骨细胞的铁死亡水平是通过激活 Nrf2/HO-1通路、恢复Wnt及PI3K/AKT/GSK-3β/P70S6k信号通路传导、上调miR-550a-3p，降低ELAVL1相关铁自噬蛋白的表达实现的。 3、褪黑素对破骨细胞的作用机制 骨再生的控制不仅需要成骨细胞的调节，还需要破骨细胞的参与。破骨细胞源于造血干细胞，核因子κB 受体活化因子配体/核因子κB 受体活化因子(receptor actvator of nuclear factor-κBligand/receptor actvator of nuclear factor-κB，RANKL/RANK)通路的活化诱导破骨细胞的形成。骨保护素是基质细胞产生的诱饵受体，与 RANKL 结合并阻止其与 RANK 的相互作用。同时，巨噬细胞集落刺激因子促进破骨细胞前体的增殖和破骨细胞的存活。 褪黑素减少与骨吸收增加有关，提示褪黑素可能是一种内源性破骨细胞抑制剂。血清中的低褪黑素水平与骨质疏松症患者的低骨密度也表现出相关性。通过抑制 MT2 受体依赖的核因子κB信号通路促进间充质干细胞的成骨分化，并由 RANKL旁分泌下调破骨细胞的生成，表明褪黑素可能通过骨保护素/RANKL/RANK 轴影响成骨细胞系细胞和破骨细胞系细胞之间的相互作用。另有研究报道是褪黑素下调核因子κB 信号通路和活化 T 细胞核因子c-1 (NFATc1) 转录因子直接抑制破骨细胞的分化，而不涉及褪黑素受体。此外，褪黑素还上调骨细胞分泌降钙素发挥对破骨细胞的抑制作用。在细胞水平上，褪黑素抑制 RAW 264.7 细胞在低浓度RANKL 和巨噬细胞集落刺激因子诱导下分化为破骨细胞。 4、褪黑素具有促进血管生成的作用 骨修复需要血液供应和血运重建来恢复受损区域，血管化是骨再生的前提和关键环节。褪黑素促进血管生成的机制是通过上调血管内皮生长因子水平促进骨髓间充质干细胞介导的血管生成，即促进骨生成-血管生成偶联。将骨髓间充质干细胞经褪黑素处理，在得到具有更高表达水平的成骨相关标志物的同时，也得到更高表达水平的血管生成相关标志物，如血管内皮生长因子、血管生成素2和血管生成素4。褪黑素纳米复合支架的成功制备，实现了褪黑素的长效缓释和成骨能力的增强。将褪黑素包埋丝素电纺丝 (melatonin-encapsuled silk Fibronin electrospun，SF@MT) 纳米纤维植入大鼠临界尺寸的颅骨缺损中，通过激活 PI3K/Akt信号通路，可显著促进骨基质沉积和新血管形成。负载褪黑素的纳米纤维海绵支架 (Scaffold@MT) 的植入也显著改善了大鼠股骨远端缺损的血管化骨再生。通过核因子红系2 相关因子 2(nuclear factor-erythroid 2-Related Factor 2,Nrf2)/血红素加氧酶1(heme oxygenase，HO-1) 信号通路，褪黑素纳米复合支架可减少血管内皮细胞的氧化应激损伤以及直接刺激血管内皮生长因子的产生，从而逆转糖尿病条件下骨生成-血管生成的解偶联并促进成骨。相关的骨组织工程的进展进一步证实褪黑素具有改善缺血组织血管生成的潜力，进而加速骨修复。不过，也有研究指出，在肿瘤、年龄相关性眼病和低氧环境中，褪黑素抑制组织内新血管生成，这与骨愈合过程中的观察结果相矛盾。 参考资料 [1]王颖,郝楠,谢戬芳.褪黑素在骨关节炎中作用机制的研究进展[J].安徽医学,2024,45(06):794-797. [2]季明意,季欣意,徐俊峰.褪黑素促进骨再生机制及在口腔种植中的应用[J].中国组织工程研究,2025,29(18):3868-3876. [3]李富华,张锦玉.褪黑素对成骨细胞作用机制的研究进展[J].中国骨质疏松杂志,2024,30(11):1678-1682. 作者简介：小泥沙，食品科技工作者，食品科学硕士，现就职于国内某大型药物研发公司，从事营养食品的开发与研究。 END 2025金笔奖征文活动开启，来投稿吧！ 领取CPHI & PMEC China 2025展会门票 智药研习社直播预告 来源：CPHI制药在线 声明：本文仅代表作者观点，并不代表制药在线立场。本网站内容仅出于传递更多信息之目的。如需转载，请务必注明文章来源和作者。 投稿邮箱：Kelly.Xiao@imsinoexpo.com ▼更多制药资讯，请关注CPHI制药在线▼ 点击阅读原文，进入智药研习社~

摘要：全球超过3亿人饱受哮喘困扰，且发病率逐年增加，作为最常见的慢性疾病之一，哮喘激发机制复杂，异质性强，是一类免疫介导的炎症疾病。随着基于生理、病理等机制深入研究，陆续推出的治疗性小分子和激素药物已实现对大多数患者的控制和治疗，但仍有5%~10%的患者为难控制、难治疗性哮喘，即重度哮喘。近十年来，得益于生物医药的迅猛发展，蛋白、抗体类药物凭借高有效性、高特异性、高安全性成为关键的重度哮喘治疗药物，然而由于生物制剂通常经注射给药，不可无创、快速地递送药物直接入肺迅速吸收起效，故而临床中亟需起效快、便捷、经济、安全的吸入式生物制剂。本综述通过对哮喘发病机制的阐释，概括现行的小分子、激素类和生物类治疗药物，并总结吸入式哮喘生物制剂的研发历程，对其未来前景进行分析，旨在加深对大分子吸入药物研究方向的认知，更新该领域前沿动态，以期为更多吸入式生物制剂的开发提供参考。关键词：哮喘；给药途径；吸入给药；生物制剂_正文_支气管哮喘简称哮喘，以呼吸急促、咳嗽和胸闷等多种症状为特征，与慢性气道炎症，广泛、可逆性呼气性气流阻塞和气道高反应性等症状有关[1]。全球超过3亿人饱受哮喘困扰，且发病率逐年增加。根据全球哮喘指南全球哮喘防治创议（global initiative for asthma，GINA）建议，需对患者采用阶梯式治疗方案，尤其推荐个性化治疗方案。随着生物制剂的发展，抗体类生物制剂已成功应用至哮喘治疗，为中重度哮喘患者带来了更有效、更安全的药物选择，但其注射的给药方式，缓慢的起效速度，频繁的入院用药、高昂的用药成本在很大程度上限制了药物的推广，故而吸入式抗体药物的临床呼声日益高涨。本综述对哮喘机制、现有治疗药物及吸入抗体药物的开发历程进行了调查研究，以期加深对哮喘发病机制及治疗药物的全面认识，同时对吸入式抗体药物的开发必要性、开发难度、研发现状进行汇总更新。1哮喘发病机制哮喘传统上被分为两类，外源性哮喘和内源性哮喘，外源性哮喘又被称为过敏性哮喘，由过敏原引起，主要归因于异常的辅助性T细胞（helper T lymphocyte，Th）2型炎症。内源性哮喘是由多种因素引发的，如阿司匹林、肺部感染、运动、寒冷、压力、肥胖等[2]。根据Th2炎症的状态，哮喘疾病又被分为高Th2和低Th2哮喘[3]。高Th2哮喘的特征是嗜酸性气道炎症，这与血液中嗜酸性粒细胞数目的增加或呼出一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）分数升高有关，而低Th2哮喘包括中性粒细胞哮喘和寡粒细胞性哮喘。哮喘的病理机制是复杂的，新研究表明，哮喘的发病机制也可不依赖于非免疫应答/炎症发生，但相关研究有限[4]。2哮喘标志物由于丰富的异质性外源、内源表型特征，哮喘非常适合精准治疗方案，因而非侵入性生物标志物的鉴别将有助于其诊断和治疗。Th2和2型固有淋巴细胞（innate lymphoid cells，ILC2）通路的激活是2型炎症哮喘发生的核心，Th2型细胞因子主要有一系列白介素（interleukin，IL），如IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-31，而ILC2s产生的2型细胞因子主要有IL-5、IL-9和IL-13，上述因子均为哮喘有效标志物。嗜酸性粒（eosinophil，EOS）细胞、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E、表达ILC2s的循环趋化因子受体（cyclic chemokine receptor，CCR）10、血浆CCL（CC chemokine ligand）27水平和Fe-NO是哮喘诊断和预后的常见生物标志物。此外，如图1所示，IgE、IgG亚族，血清IgE抑制活性，嗜碱性粒细胞活化，趋化因子和细胞因子，调节性T（regulatory T，Treg）细胞，调节性B（regulatory B，Breg）细胞和树突状细胞等标记物已被推荐作为跟踪过敏原耐受诱导治疗的生物标记物[5]。3哮喘现有小分子、激素治疗药物GINA指南推荐使用药物种类包括糖皮质激素、β2-受体激动剂、胆碱能受体阻断药物、茶碱类药物、白三烯受体拮抗剂和生物靶向制剂[6]。除上述药物外，基于创新机制的新型小分子药物研发处于临床研究不同阶段，如正大天晴的前列腺素D2受体拮抗剂（又称为CRTH2拮抗剂）TQC3564正在中国临床I期研究阶段；针对磷酸二酯酶4（PDE4）抑制剂的NCT04108377正处于临床I期患者招募阶段。此外，基于蛋白激酶抑制剂（NCT00676572）、选择性糖皮质激素受体调节剂（AZD7594）、他汀类药物（NCT02433535）均以控制哮喘为目标并处于临床开发中[7]。新型小分子哮喘治疗药物的有效开发离不开对哮喘机制以及哮喘的不同表型和内型的理解，但从临床效果上看，针对中重度哮喘，生物制剂展现出更加明确的应用前景，因此在另一方向上，生物靶向药物的发展也在高歌猛进，力求在新维度上实现哮喘疾病的控制及治疗。4哮喘现有靶向治疗药物随着病情严重，在以糖皮质激素为基础治疗后仍会出现控制不佳、反复重症发作等情况，此时患者即可被认定是重度患者，高达10%的成人和2.5%的儿童哮喘群体患有重度哮喘，因固定气流受限、病情恶化、常年就医、住院和死亡风险的增加等因素致使生活质量严重下降。因此，在整个哮喘患者谱系中，重症哮喘患者是临床中最迫切的未满足医疗需求群体，目前推荐的有效控制方案是生物制剂添加疗法。目前共6款针对Th2通路的哮喘治疗性单克隆抗体获批，包括靶向IgE的奥马珠单抗（omali-zumab）、靶向IL-5的瑞替珠单抗（reslizumab）、IL-5受体药物贝那利珠单抗（benralizumab）、针对IL-4Rα的度普利尤单抗（dupilumab）以及靶向TSLP的特泽鲁单抗（tezepelumab）。目前针对低Th2型、中性粒细胞为主的重度哮喘发病机制相关分子靶点的试验性药物非常稀缺，因此，针对不同表型基础生物学机制的深入研究将对临床有关重度哮喘治疗方案的开发起到关键性驱动作用[8]。抗体类生物制剂的获批为重度哮喘病人带来了更新、更安全、更有效的治疗方式，表1对Th2通路相关靶点哮喘治疗药物关键信息进行统计，以期对哮喘生物制品有更为系统的理解。上述靶向药物已在临床试验及疾病用药过程中验证了有效性和安全性，多种潜在疾病治疗靶点药物研发正在进展中，包括细胞因子、膜分子和细胞内信号通路，如IL-37、IL-11，基质相互作用分子1（STIM1），CD200R、OX40L和CD30L、HMGB等[9]。5吸入式大分子哮喘治疗药物发展现状5.1 药物通过吸入途径递送的优势吸入给药（肺给药）可快速、无创地输送至呼吸道并传导至肺部，肺内巨大的表面积和广泛的血管分布能使药物快速吸收并发挥治疗效果，其剂量对身体其他部位的暴露量较低，可最大限度地减少全身性不良反应。吸入给药是一种无创的局部和全身给药方式，在治疗多种疾病方面具有巨大的潜力，已应用于包括哮喘、慢性阻塞性肺疾病、呼吸道病毒感染和糖尿病、囊性纤维化等多种疾病领域[10]。吸入给药作为治疗呼吸系统疾病优选的给药方案，可满足如下几项对给药方式的特殊需求[11]：（1）药物通过系统性给药在肺内很难达到有效富集的药物浓度，生物利用度低，而吸入给药具有肺内高浓度的优势。（2）当以达到肺部有效治疗浓度为目标给药时，药物剂量通常较大并呈现全身性毒性，吸入给药用药量低，规避胃肠降解作用和肝脏首过效应，安全性更好。（3）需要快速起效的肺部疾病治疗药物，吸入给药可快速实现肺部药物沉降，并由于肺部表面积大、血管化丰富、组织通透性好，药物可以快速吸收并起效。（4）在确保肺部疾病治疗药物药效的同时，若对用药成本关注，亦通过吸入给药的方式改进。5.2 吸入制剂的临床应用吸入型产品可分为雾化溶液吸入、干粉吸入和软雾吸入三大种类，吸入制剂被广泛应用于多种呼吸系统疾病领域[11]：如（1）糖皮质激素、β2受体激动剂、毒蕈碱乙酰胆碱受体拮抗剂等激素和小分子类吸入制剂（组合）用于哮喘和慢性阻塞性肺疾病治疗。（2）妥布霉素、氨曲南赖氨酸盐、左氧氟沙星、阿米卡星、多粘菌素、神经氨酸酶抑制剂、利巴韦林、喷他脒等吸入制剂在抗感染领域的应用。（3）吸入重组人脱氧核糖核酸酶在囊性纤维化适应症的治疗应用。（4）吸入甘露醇在气道黏液清除、囊性纤维化及支气管扩张中的应用。（5）吸入前列腺环素发挥血管扩张机制用于肺动脉高压的治疗。（6）吸入肺表面活性剂用于呼吸窘迫综合征的治疗。（7）吸入核酸药物如重组新型冠状疫苗在抗病毒感染领域的开发应用。吸入制剂主要应用在呼吸系统疾病领域，但从口鼻吸入通过呼吸道将药物递送至肺部并交换进入体循环，也为系统性疾病的治疗提供了创新性的方案[11]。在中枢神经系统领域，尼古丁吸入剂（器）已在尼古丁替代疗法中得到成功应用以减轻或摆脱尼古丁依赖。全球首款左旋多巴吸入粉雾剂INBRIJA®已在美国和欧盟获批上市用于帕金森的吸入治疗。糖尿病领域，辉瑞与Mannkind曾先后获批两种吸入胰岛素药物Exu-bera®与Afrezza®，为糖尿病治疗提供了新的治疗选择。5.3 吸入大分子药物在哮喘治疗领域的开发现状抗体具有高特异性、高亲和力和高安全性等优势，已被广泛用于治疗肺部疾病，如肺癌和严重哮喘。目前共有6款针对重度哮喘的单克隆抗体上市，并取得了优异的临床治疗效果。然而，已上市产品均以皮下注射或静脉输注方式递送，其局限性包括侵入性、系统毒性（如细胞因子风暴），需专业医师操作等因素使得大量患者难以院外治疗。因此，吸入给药凭借直接呼吸道给药，无创、局部效应增强、全身暴露最小和易于自我给药等优点，已在多个吸入性单克隆抗体及其衍生物在临床试验中得到治疗潜力的评估[12]，表2汇总了吸入式生物制剂在哮喘领域的简要总结。5.3.1 吸入单克隆抗体/片段诺和诺德及诺华曾在轻度过敏性哮喘患者中开展了奥马珠单抗自我雾化给药疗效研究，虽然33名受试者在分别连续雾化用药2周和8周后血清中均检测到奥马珠单抗，但血清IgE水平无明显变化，变应原诱导的气道反应不受抑制，推测无效的原因是肺组织中覆盖IgE效应细胞的奥马珠单抗浓度不足，无法中和肺部产生的IgE。此外，一名受试者产生了抗奥马珠单抗抗体，这也令人担心吸入单抗可能比注射给药免疫原性更强[13]。2014年，来自比利时的研究团队发表了关于雾化吸入抗原结合片段（fragment of antigen binding，Fab）在哮喘小鼠模型（NMRI）中的研究结果[14]，该研究通过聚乙二醇化延长了IL-17A Fab2和IL-13Fab双抗在呼吸道局部停留时间，肺内聚乙二醇化抗体含量在给药后4h达到平台期，而未成功偶联聚乙二醇的抗体则入肺后就开始清除，研究阐释了聚乙二醇化修饰对治疗性蛋白局部递送到肺部后的长效具有显著效果。此后，该团队又相继针对不同分子量聚乙二醇分别对IL-17A Fab和IL-13Fab长效后肺部沉积进行了探索，上述研究主要聚焦肺部药物长效化机制研究，并未对抗体靶点组合的药效及成效性进行深入探索，但初步论证了吸入抗体给药途径的可行性。比利时布鲁塞尔的优时比制药（UCB Pharma）在食蟹猴过敏性哮喘模型中布局了针对雾化吸入IL-13靶点Fab抗体CDP7766的研究，该研究发现通过振动网筛雾化器产生的气溶胶仍保持优异的分子活性及纯度，没有明显的降解和聚体产生，并且在动物模型中表现出良好的耐受性，未观察到局部刺激相关的不良反应，并显著抑制了肺泡灌洗液中过敏原诱导的细胞因子和趋化因子的上调，临床上可快速持久地抑制FeNO，健康和哮喘受试者均表现出良好的耐受性（NCT02473939），证明了吸入性抗IL-13抗体片段药物治疗过敏性哮喘的潜力[15]。Faghihi等通过喷雾干燥将肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNFα）单克隆抗体Infliximab开发成干燥粉剂，用于局部炎症性哮喘治疗，探讨通过吸入给药途径抑制肺部分泌TNFα的可行性，但其粉剂分子与TNFα结合降低了21%，在卵清蛋白刺激小鼠哮喘模型中表现出的TNFα分子抑制活性相对于单抗降低了2个数量级，虽然抗体干粉开发成功与否主要取决于喷雾干燥条件、配方成分及抗体雾化稳定性，但该研究初步提示了单克隆抗体并不合适用于吸入制剂开发[16]。CSJ117是诺华布局的一款针对TSLP靶点的Fab拮抗剂（Ecleralimab），CSJ117采用粉雾剂药物开发方式用以治疗成人轻度特应性哮喘，在其I期临床研究（NCT03138811）中，CSJ117耐受性良好，并减轻过敏原激发后的支气管收缩[17]。2020年诺华启动了一项II期试验，目的是研究CSJ117治疗未得到控制的重度哮喘的药效和安全性研究（NCT04410523），II期临床研究已完成，但暂未数据揭盲，并且由于诺华产业战略调整，该项目暂停了后续开发，正在积极寻求合作转让。安进及阿斯利康在携手成功推出TSLP单克隆抗体Tez-epelumab商业化上市后，快速对上市药物分子进行工程化改造将单克隆抗体皮下注射液开发成为Fab干粉吸入剂型，项目代码为AMG104/AZD8630，该项目已于2022年启动临床I期研究，以评估安全性、耐受性和药代动力学（NCT05110976）。5.3.2 吸入纳米抗体除了单克隆抗体及抗体片段外，诸如Nanobodies®、Anticalin®、Affibody®等新型蛋白骨架类型在基于蛋白质的吸入治疗领域引起了轰动。与全长单克隆抗体相比，新型蛋白骨架体积较小、结构简单，更容易结合隐蔽结合位点、组织渗透面积更大、药物聚集更方便、热稳定性更强[18]。纳米抗体是由驼科动物体内重链抗体（95kDa）可变区扩增而来的单域抗体，又称为VHH抗体（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody，VHH），从属于基因工程抗体范畴。纳米抗体晶体尺寸直径2.5nm，长4nm，是目前可与抗原结合的最小片段。2018年，首创的Nano-body®caplacizumab（Cablivi®）获得欧洲药品管理局的首个上市许可，用于治疗获得性血栓性血小板减少性紫癜，虽然caplacizumab是肠外用药，但吸入型Nanobody®平台及产品一直在临床开发中。吸入型抗合胞病毒纳米抗体药物ALX-0171的安全性和耐受性已在一项首次婴儿I/IIa期临床试验中得到证实，并观察到抗病毒活性[19]。尽管IIb期剂量范围研究已经完成（NCT02979431），但在下呼吸道感染和炎症发生的基础上，继续雾化ALX-0171并不能改善临床治疗结果，所以该项目未达预期而被搁置研究，但该研究表明ALX-0171在早期的使用干预可产生重要的临床抗病毒作用。随着新冠疫情爆发，许多纳米抗体也被开发成吸入制剂以对抗SARS-CoV-2感染，如洛启生物的Nb11-59表现出强效的体外真病毒中和活性[20]。在哮喘类领域，目前有两款来自洛启生物的纳米抗体吸入产品处于中国临床I期开发阶段，洛启生物靶向IL-4Rα的LQ036产品适应症为嗜酸性粒细胞哮喘，LQ043H靶向TSLP，其适应症为非嗜酸性粒细胞哮喘。LQ036与LQ043H是目前全球推进速度最快的同靶点吸入纳米抗体产品。LQ036及LQ043H均具有优异的体外阻断活性，并按照吸入制剂开发标准进行了完整的空气动力学研究，具有雾化后粒径均匀、生物活性完整保留、药物纯度稳定等优势，同时两款产品均采用毕赤酵母生产系统表达，产量高，工艺简单，药物成本优势明显。LQ036已完成针对安全性、耐受性、免疫原性和药代动力学的澳洲临床I期研究（NCT04993443），安全性、耐受性优异，无药物相关免疫原性发生；目前该项目正处于中国临床I期开发阶段，评价雾化经口吸入LQ036在中国健康受试者体内的耐受性、安全性、免疫原性和药代动力学（CTR20223011）。洛启LQ043H项目同期处于中国临床I期研究阶段，评价LQ043H单域抗体雾化液在中国健康受试者中单次给药后的耐受性、安全性、药代动力学和免疫原性（CTR20230092）。此外，LQ036的慢性阻塞性肺疾病适应症IND申请获得国家药监局药品审评中心（CDE）受理（受理号：CXSL2300435）。LQ036和LQ043H的顺利推进将为纳米抗体在吸入给药方向上的临床应用提供有力支持，并创新性地为哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者提供更有效、更安全、更便捷、更经济的治疗方案。5.3.3 吸入类抗体骨架蛋白Anticalin®是Astra Zeneca与Pieris公司蛋白研发平台推出的一类基于丰富血浆及体液来源脂质运载蛋白骨架修饰开发而成的工程化蛋白，通过对脂质运载蛋白1进行定向蛋白质突变，经过系统性修饰推出了Elarekibep项目（PRS-060），Elarekibep是一款靶向IL-4Rα的高亲和力、缓慢解离、长效拮抗剂，用于治疗中度至重度哮喘。Elarekibep的小尺寸和稳定性使其可以被直接吸入肺部，其临床I期以雾化液方式开展，试验显示轻度哮喘患者的FeNO水平显著降低（NCT03384290，NCT03574805）。在其干粉吸入制剂临床II期向3mg及1mg更低剂量组进行药效探索时，其非人类灵长类动物长期毒性研究出现了非药物剂量依赖的炎症介导的肺组织损伤，随即其合作方阿斯利康终止了该项目后续临床开发（NCT04643158）。该项目的失败原因更多指向于Anticalin®平台分子自身结构毒性问题，这一结论为类抗体支架蛋白Anticalin®的未来研发应用蒙上了阴影[21]。Affibody®是Affibody公司推出的一类新型抗体模拟物，该类药物是由58个氨基酸残基组成的新型亲和配体，相对分子质量约为6500，由3个螺旋结构组成，功能与抗体相似，但具备相对分子质量小、折叠速度快、选择性和亲和力高、结构稳定等优势。Affibody最近宣布接受Chiesi投资，使用Affibody专有技术布局开发呼吸系统疾病吸入性创新疗法，根据公司最新官网更新，ABY-062作为一种靶向TSLP的候选药物，很有可能是按照吸入式治疗药物方向开发，这也意味着吸入大分子药物开发行列迎来了新抗体骨架Affibody®的加入，我们期待其在吸入性创新疗法上的表现。5.3.4 吸入重组蛋白除吸入抗体类药物之外，重组蛋白也曾尝试开发成吸入制剂。拜耳医药曾尝试过IL-4蛋白突变体雾化吸入开发方向，Pitrakinra（AER-001，BAY-16-9996）是IL-4蛋白的变体，具有2个氨基酸变化，使其能够结合IL-4Rα链并抑制IL-4Rα与γC或IL-13Rα1的相互作用。在Pitrakinra的一项II期临床研究中，吸入Pitrakinra可减弱过敏原激发后哮喘受试者的晚期哮喘反应和气道炎症，但对哮喘患者应对过敏原挑战的肺功能没有显著影响[22]。虽然在一项药物遗传学研究中，在携带IL-4Rα基因特异性单核苷酸多态性的患者中，Pitrakinra显著降低哮喘急性发作的频率，但最终其临床III期不明原因并未继续推进。Altrakincept是一款通过雾化给药开发的竞争性重组人可溶性IL-4Rα蛋白，已在临床试验中进行了测试，并证明可预防中重度哮喘患者因停用皮质类固醇而导致的肺功能恶化，但进一步的长期研究结果令人失望，该项目也未再进一步推进[23]。6小结在过去的15年里，生物制剂的开发和临床应用显著扩大，但这些药物的给药途径仍主要以局部或系统性注射为主，吸入抗体是一种明显的无创替代方案，为多种疾病的局部治疗提供了机会，尤其对于呼吸系统疾病治疗，同时也尝试应用于系统性疾病的治疗。但由于抗体三维结构复杂，三级结构是其作用的核心，在吸入给药过程中遭受各种应力下容易产生降解和聚体，这种结构的破坏严重影响产品有效性和安全性等性能的评估，所以维持其结构完整性和生物活性对于成功开发吸入性生物制剂至关重要，这无疑对分子特性、配方设计、辅料选择、加工工艺和吸入装置等方面提出了系统性挑战。后续基础研究对上皮细胞转运机制的理解，辅助抗体稳定性、吸收和雾化性能的相容性赋形剂的开发，适配性更高、便携性更好、操作更便捷吸入装置的开发等都会对吸入抗体药物的开发提供更坚实的开发基础。并且随着纳米抗体、抗体片段、抗体骨架等新形式生物制剂的诞生为更多创新药物的开发提供了保障，未来我们期待更多吸入相关创新技术的诞生。总而言之，吸入型生物制剂的开发是一个系统过程，需要全面、充分考虑发病机理、患者群体、药物分子类型选择及其与肺内生物屏障的相互作用等因素，并合理地选择制剂、赋形剂和装置，同时也涉及上述学科和领域的共同发展。我们希望未来会有治疗效果更佳、安全数据更好、自行用药更便捷、药物价格更低廉的吸入生物制剂产品的诞生以满足日渐复杂、日益壮大的临床未满足需求。参考文献详见《中国临床药理学与治疗学》 2024 Apr; 29(4)识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

cGAS–STING通路是一种进化上保守的免疫信号通路，对微生物防御至关重要（STING：天然免疫新核心，免疫治疗新靶点）。与其他主要依赖于固定信号事件的先天免疫途径不同，STING在细胞中具有高度的流动性，流动性异常与神经退行性疾病等相关。STINGSTING是一种跨膜蛋白，以二聚体的形式存在于内质网上，其CDN结合结构域面对细胞质。在配体结合之前，每个STING单体的连接区域被交叉，配体结合结构域位于各自的跨膜结构域的另一侧。cGAMP的结合诱导了连接体区域的结构重排，其中配体结合结构域被旋转到与跨膜结构域平行。这种旋转被认为是STING激活和内质网通过COPII囊泡离开的关键。然后STING易位到内质网中间室（ERGIC）和高尔基体，在那里它招募激酶TBK1，它磷酸化STING本身和转录因子IRF3。磷酸化的IRF3易位到细胞核，启动IFN-I基因和ISGs的转录。此外，在这一过程中，STING激活了其他IFN非依赖的信号通路，分子细节未知。STING囊泡然后退出反式高尔基网络（TGN），继续前往核内体和溶酶体，在那里，STING囊泡最终被降解以终止信号传导。STING转运三步1. STING在内质网上STING不包含将其引导到内质网的信号序列，但为什么STING定位于内质网，并保持在内质网?帮助内质网保持STING的过程包括Ca2+传感器基质相互作用分子1（STIM1）和逆行COPII囊泡运输。STIM1通过钙通道控制Ca2+进入内质网，这在淋巴细胞的激活和增殖中至关重要。STIM1也通过直接绑定STING的ER保留因子。使用2,3-cGAMP的刺激会破坏这种相互作用，从而允许STING内质网退出。STIM1的缺失从内质网释放出STING，导致tonic IFN-I信号。所以STIM1缺陷的患者同时出现淋巴细胞减少（由于淋巴细胞中的钙通量缺陷）和自身免疫病。高尔基体-内质网逆行穿梭也起着重要作用。STING不是简单地固定在静息状态下的内质网上；相反，它通过分泌途径不断移动。内质网保留因素和逆行穿梭的结合可能建立了STING内质网定位的“表象”。此外，还有其他的辅助因子负责调节内质网上的STING蛋白水平，包括toll相互作用蛋白（TOLLIP）、E3泛素连接酶三部分基序蛋白30α（TRIM30α）和PTPN1/ 2，它们分别调节稳态下STING的溶酶体和蛋白酶体降解。2. 从内质网转移至高尔基体配体结合后，STING开始从内质网易位到高尔基体，这个过程需要COPII囊泡的组装。Sar1、Sec13、和Sec31的丢失阻止了STING配体结合时离开内质网，并减弱了STING信号。除了经典的COPII囊泡装置外，内质网上的其他一些蛋白质和复合物对STING从内质网到高尔基体的运输也很重要。在没有转位子复合物成分TRAPβ的情况下，配体诱导的STING运输被阻止。内质网蛋白iRhom2促进TRAPβ和STING的相互作用。与TRAPβ缺陷类似，iRhom2的丢失也会阻止STING从ER离开。由于TRAPβ和iRhom2不影响COPII装置的蛋白质运输，它们可能调节内质网的横向移动，以到达ER出口位点。一旦STING到达高尔基体，就会引发一系列的生化事件：(1)通过CTT招募TBK1；(2) TBK1磷酸化STING（丝氨酸366）和自身；(3)STING使IRF3聚合并招募到ILxIS基序，TBK1磷酸化IRF3；(4) p-IRF3二聚并易位到细胞核以开启免疫基因表达。除了磷酸化，其他翻译后修饰对高尔基体上的刺信号至关重要。例如，STING在半胱氨酸88和91处被顺式高尔基体定位的酰基转移酶DHC3/7/15棕榈酰化。用硝基呋喃衍生物C-178、C-179和H-151阻断刺棕榈酰化，可以防止STING寡聚和信号体组装。多种蛋白（AMFR、INSIG1、ZDHHC1、RNF26、TRIM32和TRIM56）对STING的泛素化对高尔基体的信号转导也很重要。此外，一些蛋白质辅助因子直接或间接地促进高尔基体上刺信号体的形成。S6K和SREBP裂解激活蛋白（SCAP）促进IRF3招募到STING-TBK1。而核心自噬蛋白ATG9a在膜扩张中负调控STING-TBK1复合物的形式和下游IFN信号传导，蛋白磷酸酶Mg2+/Mn2+依赖的1a和蛋白磷酸酶6催化亚基通过去磷酸化抑制信号传导。IFN-高尔基体易位也是抑制独立活性所必需的。例如，STING介导的NF-κB信号通路需要TBK1与高尔基体上的刺c端结合，但不需要STING磷酸化。STING介导的自噬需要STING从内质网转移到ER-GIC，这是自噬膜的一个已知来源。STING介导的UPR和细胞死亡需要STING从内质网退出。有趣的是，STING介导的UPR和自噬活性都被定位到相同的基序上（一个包含氨基酸322-343的α-螺旋），这表明这两种活性可能依赖于一个尚未确定的共同过程。STING内质网单独退出（在到达ERGIC或高尔基体之前）是否诱导任何细胞信号也不清楚。3. 后高尔基体穿梭和溶酶体降解虽然有许多已知的STING辅助因子在内质网到高尔基体阶段起作用，但已知的高尔基体后STING转运的辅助因子要少得多。后高尔基体的STING运输减弱了IFN信号。因此，这些辅助因子的功能缺失将延长STING信号。一旦STING在高尔基体上被磷酸化，STING降解的过程就开始了。适配器蛋白复合物1（AP-1）结合一个双亮氨酸基序以及在STING CTT结构域磷酸化的S366残基。然后，AP-1将磷酸化的STING分类到clathrin蛋白包被的囊泡中，运输到内溶酶体。AP-1的抑制增强了STING信号。STING高尔基体出口也需要反式高尔基GRIP和包含蛋白2的螺旋-螺旋结构域2（GCC2/ GCC185）。GCC2属于TGN上的Golgin蛋白家族，通过APs将囊泡转移到RAB GTPases。TGN是一个主要的分拣枢纽，在这里各类物质被分类到各种运输工具，以贩运到细胞的不同区室)。一旦STING到达核内体，它再次被UBE2N泛素化。HGS、VPS37A、UBAP1、Tsg101和Vps4是STING辅助因子。C9ORF72和UNC93B1也能促进STING溶酶体降解，尽管分子细节仍有待确定。STING还驱动非经典的自噬，这可能有助于其自身被自噬小体降解。目前还不清楚STING囊泡是与溶酶体融合还是被溶酶体吞噬，以及膜拓扑结构在每种情况下是如何工作的。参考资料Chu, T.-T., X. Tu, K. Yang, J. Wu, J.J. Repa, and N. Yan. 2021. Tonic primeboost of STING signalling mediates Niemann-Pick disease type C. Nature. 596:570–57Decout, A., J.D. Katz, S. Venkatraman, and A. Ablasser. 2021. The cGAS-STING pathway as a therapeutic target in inflammatory diseases. Nat. Rev. Immunol. 21:548–569