G3BP1

这次我们介绍他的另一篇文章“Diffusing protein binders to intrinsically disordered proteins”，该文章介绍了一种仅通过序列信息，不需要结构信息，开发靶向一般性IDPs/IDRs的设计方法。 这篇文章仍在预印本上发表，到目前为止尚未正式发表。我们看一下Baker在这篇文章中是如何根据序列信息开展无序结构binder设计的。 ——核心内容—— 本篇文章致力于根据序列信息而非几何结构信息发展靶向无序蛋白高亲和力binder的方法。通过RFdiffusion来训练PDB库中的双链体系的数据，通过对双链体系中的其中一条链添加噪音，而另一条链仅给出序列信息，这样的做法或许可以得到达到目标的能力。这种方法之前被用于生成具有螺旋结构的生物活性肽激素的binder。现在希望将这种方法应用于无序蛋白（大部分并不兼容适配于连续的螺旋构象）。为了靶向更短的无序区，作者借鉴Sahtoe等人使用Rosetta的链配对方法和RFdiffusion对链不同的可变构象进行采样，通过主链-主链之间的氢键和侧链-侧链之间相互作用最大化，可以生成通用的方法，在较短区域实现相互作用的最大化，从而产生binder。（具体内容可以见原文和参考文献11、13、14） 图1.关于IDRs的binder设计的主要方法 ——实验结果1—— 作者首先对Amylin（37个残基调节血糖的激素）进行了binder生成，仅输入Amylin的序列信息，采用针对柔性目标进行微调的RFdiffusion的方法，生成了包含Amylin和其binder的各种构象的复合物，在连续的去噪步骤中，Amylin呈现出不同的构象，而binder的残基分布围绕Amylin变化，逐渐组织成一个折叠的结构，几乎环绕在Amylin的整个表面。然后使用ProteinMPNN对主链库进行序列设计，使用AlphaFold2对单体构象进行筛选以及复合物起始构象的猜测，此时通过实验进行了初步验证，再使用了一种双侧部分扩展的方法，使得peptide与binder的构象更好的适配。最终得到了结合Amylin纳摩尔的binder（BLI实验），并且复合物中Amylin重要的二硫键均得到保留。接着又对C-Peptide（胰岛β细胞分泌的31个残基的肽）进行了binder设计，效果最好的CP-35结合力为28 nM。以及对VP48（39个残基的转录激活因子）的binder设计，效果最好的VP-48结合力为39 nM。 图2.无序结构binder设计及亲和力测定 ——实验结果2—— 对于靶向较短的片段，RFdiffusion生成的设计中具有较好指标的，往往是那些具有β折叠构象的靶标，为了提高此类设计的效率，作者在Rfdiffusion序列输入方法中加入了定义靶标二级结构的能力，使得目标序列全部或部分为螺旋、折叠和环区的构象，这对β链构象尤其重要，因为β链的构象在实际的三维空间中会有较大变化。新加入的能力可以更好地应对β链构象的复杂性。紧接着作者利用它对3个无序区域设计了binder。G3BP1是一个与核酸相分离相关蛋白，其RNA结合区（KPGFGVGRGLAPR，13 个氨基酸）RBD非常重要，针对此进行binder设计，指定二级结构为β链，最终在所有通过筛选的设计中，目标都含有β链构象。通过筛选，实验验证以及双侧部分扩散的进一步优化，进行了10000条轨迹模拟，最终得到G3bp1-11（亲和力11 nM）。接着作者对朊蛋白淀粉样核心区域的180-187位（VNITIKQH）进行了binder设计，同样指定了其二级结构为β链，PRI28效果最好，Kd为14 nM。作者还对IL2RG（细胞因子共同 γ 链）的氨基酸残基327-336位（ERLCLVSEIP）进行了binder设计，效果最好的IL2RG-30，亲和力为97 nM。  作者分别解析了Amylin-22αβL和G3bp1-11与各自一个binder的复合物结构，结果显示两者的复合物结构均与计算设计的结构一致。Amylin-22αβL与binder、G3bp1-1与binder的X-ray结构与计算预测结构之间复合物的骨架Cα RMSD分别是2.04 Å和0.80 Å。 除此之外，作者通过all by all的方式检测了binder对靶标的特异性，图3显示这些binder均具有良好的特异性。最后作者通过IL2RG及binder在Hela细胞中的共定位和binder对Amylin-22αβL纤维聚集的影响等实验证明了无序蛋白的蛋白binder具有在细胞内正确折叠、结合靶标和调控靶标功能的能力。 图3.无序结构binder的特异性 ——总结—— 总的来说，Baker在"Diffusing protein binders to intrinsically disordered proteins"这篇文章中描述了仅通过序列信息即可设计无序结构（几个氨基酸残基到三四十残基）binder的方法，并进行了实验验证。本系列的两篇无序蛋白binder设计工作表明蛋白配体在高特异、高亲和地调控无序蛋白上大有可为。 参考文献： [1] bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2024.07.16.603789 作者：程北溟 审稿：王瀚平 编辑：郭   政 版权声明：本文内容及图片，如有侵权请联系删除。 免责声明：本文内容仅作信息交流学习，并不反映任何意见及观点。 往期推荐 乐威医药荣获2024年度EcoVadis承诺奖牌 乐威医药再获三项国家专利知识产权 乐威医药公益3.12植树行动

在之前的推送中我们介绍了诺奖得主David Baker在BioRxiv上发表的预印本文章——"Sequence-specific targeting of intrinsically disordered protein regions"，（作者通过 “口袋生成”“口袋组装”“穿连装入”“精修改善”这四步完成了针对IDRs的binder的设计。）这次我们介绍他的另一篇文章“Diffusing protein binders to intrinsically disordered proteins”，该文章介绍了一种仅通过序列信息，不需要结构信息，开发靶向一般性IDPs/IDRs的设计方法。 这篇文章仍在预印本上发表，到目前为止尚未正式发表。我们看一下Baker在这篇文章中是如何根据序列信息开展无序结构binder设计的。 ——核心内容—— 本篇文章致力于根据序列信息而非几何结构信息发展靶向无序蛋白高亲和力binder的方法。通过RFdiffusion来训练PDB库中的双链体系的数据，通过对双链体系中的其中一条链添加噪音，而另一条链仅给出序列信息，这样的做法或许可以得到达到目标的能力。这种方法之前被用于生成具有螺旋结构的生物活性肽激素的binder。现在希望将这种方法应用于无序蛋白（大部分并不兼容适配于连续的螺旋构象）。为了靶向更短的无序区，作者借鉴Sahtoe等人使用Rosetta的链配对方法和RFdiffusion对链不同的可变构象进行采样，通过主链-主链之间的氢键和侧链-侧链之间相互作用最大化，可以生成通用的方法，在较短区域实现相互作用的最大化，从而产生binder。（具体内容可以见原文和参考文献11、13、14） 图1.关于IDRs的binder设计的主要方法 ——实验结果1—— 作者首先对Amylin（37个残基调节血糖的激素）进行了binder生成，仅输入Amylin的序列信息，采用针对柔性目标进行微调的RFdiffusion的方法，生成了包含Amylin和其binder的各种构象的复合物，在连续的去噪步骤中，Amylin呈现出不同的构象，而binder的残基分布围绕Amylin变化，逐渐组织成一个折叠的结构，几乎环绕在Amylin的整个表面。然后使用ProteinMPNN对主链库进行序列设计，使用AlphaFold2对单体构象进行筛选以及复合物起始构象的猜测，此时通过实验进行了初步验证，再使用了一种双侧部分扩展的方法，使得peptide与binder的构象更好的适配。最终得到了结合Amylin纳摩尔的binder（BLI实验），并且复合物中Amylin重要的二硫键均得到保留。接着又对C-Peptide（胰岛β细胞分泌的31个残基的肽）进行了binder设计，效果最好的CP-35结合力为28 nM。以及对VP48（39个残基的转录激活因子）的binder设计，效果最好的VP-48结合力为39 nM。 图2.无序结构binder设计及亲和力测定 ——实验结果2—— 对于靶向较短的片段，RFdiffusion生成的设计中具有较好指标的，往往是那些具有β折叠构象的靶标，为了提高此类设计的效率，作者在Rfdiffusion序列输入方法中加入了定义靶标二级结构的能力，使得目标序列全部或部分为螺旋、折叠和环区的构象，这对β链构象尤其重要，因为β链的构象在实际的三维空间中会有较大变化。新加入的能力可以更好地应对β链构象的复杂性。紧接着作者利用它对3个无序区域设计了binder。G3BP1是一个与核酸相分离相关蛋白，其RNA结合区（KPGFGVGRGLAPR，13 个氨基酸）RBD非常重要，针对此进行binder设计，指定二级结构为β链，最终在所有通过筛选的设计中，目标都含有β链构象。通过筛选，实验验证以及双侧部分扩散的进一步优化，进行了10000条轨迹模拟，最终得到G3bp1-11（亲和力11 nM）。接着作者对朊蛋白淀粉样核心区域的180-187位（VNITIKQH）进行了binder设计，同样指定了其二级结构为β链，PRI28效果最好，Kd为14 nM。作者还对IL2RG（细胞因子共同 γ 链）的氨基酸残基327-336位（ERLCLVSEIP）进行了binder设计，效果最好的IL2RG-30，亲和力为97 nM。  作者分别解析了Amylin-22αβL和G3bp1-11与各自一个binder的复合物结构，结果显示两者的复合物结构均与计算设计的结构一致。Amylin-22αβL与binder、G3bp1-1与binder的X-ray结构与计算预测结构之间复合物的骨架Cα RMSD分别是2.04 Å和0.80 Å。 除此之外，作者通过all by all的方式检测了binder对靶标的特异性，图3显示这些binder均具有良好的特异性。最后作者通过IL2RG及binder在Hela细胞中的共定位和binder对Amylin-22αβL纤维聚集的影响等实验证明了无序蛋白的蛋白binder具有在细胞内正确折叠、结合靶标和调控靶标功能的能力。 图3.无序结构binder的特异性 ——总结—— 总的来说，Baker在"Diffusing protein binders to intrinsically disordered proteins"这篇文章中描述了仅通过序列信息即可设计无序结构（几个氨基酸残基到三四十残基）binder的方法，并进行了实验验证。本系列的两篇无序蛋白binder设计工作表明蛋白配体在高特异、高亲和地调控无序蛋白上大有可为。 参考文献： [1] bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2024.07.16.603789 作者：程北溟 审稿：王瀚平 编辑：郭   政

▎药明康德内容团队编辑（来源：中国科学院分子细胞科学卓越创新中心） 近日，《分子细胞》（Molecular Cell）在线发表了中国科学院分子细胞科学卓越创新中心陈玲玲研究组与复旦大学杨力研究组合作完成的关于内源环形RNA降解的最新研究成果。该研究解析了生理条件下环形RNA被核酸内切酶DIS3监控降解的新机制，实现了对环形RNA“生老病死”过程中特异调控及分子特征等基础研究的闭环。 环形RNA由mRNA前体外显子反向剪接而成，具有区别于线性RNA的生成加工、转运代谢和功能发挥途径与调控规律。有研究发现，在应激条件下，双链RNA病毒激活核酸酶RNase L可导致环形RNA大规模降解；而正常条件下，仅有个别含m6A修饰或具特殊结构的环形RNA可被降解。但是，正常条件下环形RNA代谢稳态维持的分子机制尚不清楚。 一般认为，环形RNA的闭环结构使其对核酸外切酶不敏感而依赖核酸内切酶。基于这一推测，该研究对不同核酸内切酶如ANG、DIS3、ERN1、G3BP1、RNASE4、RNAESH2A、SMG6以及辅因子UPF1、UPF2进行敲降筛选，发现敲降核酸内切酶DIS3引起细胞内大部分环形RNA的表达上调。 研究使用核酸内切酶失活的DIS3突变体进行回补实验和RNA免疫沉淀测序实验，发现了这些环形RNA的表达上调依赖DIS3的核酸内切酶活性，且DIS3能够直接结合由DIS3敲降引起的表达上调的环形RNA。进一步，研究显示，DIS3介导的环形RNA降解途径在人和小鼠中高度保守。 ▲核酸内切酶DIS3降解环形RNA及机制（图片来源：原始论文[1]） DIS3具有核酸内切酶活性和3'-5'端的核酸外切酶活性，在细菌到人等多数生物中广泛存在。此前，研究认为，DIS3是核酸外切酶复合体的重要组分，在细胞核内发挥调控RNA加工、成熟与质量监控的作用。而进一步研究发现，DIS3具有不依赖于核酸外切酶复合体，在细胞浆内降解环形RNA的全新途径和机制。该研究通过蔗糖密度梯度离心实验发现，DIS3介导的环形RNA降解途径发生在细胞浆中。 同时，免疫荧光共定位显示，仅有10%的DIS3与核酸外切酶复合体组分共定位，提示DIS3具有不依赖于核酸外切酶复合体的功能。进而，研究通过蔗糖密度梯度离心实验、DIS3敲降实验和高通量测序，对筛选出DIS3偏好降解的环形RNA与非DIS3偏好降解的环形RNA进行序列比较分析，鉴定发现具有U-rich motif的环形RNA易被DIS3识别和降解。 更重要的是，研究通过建立环形RNA的切割实验，证明体外合成的环形RNA在体外和细胞内均有可控的稳定性，即含有U-rich基序数目不同，可改变环形RNA的稳定性，且该过程依赖DIS3活性。 这一研究揭示了正常细胞状态下DIS3介导的全转录组水平环形RNA降解的新途径，发现了DIS3不依赖于核酸外切酶复合体的新功能，为体外合成稳定性可控的环形RNA奠定了理论基础。 研究工作得到国家自然科学基金委员会、科学技术部、中国科学院等的支持。 原始论文： [1]Double-opponent spiking neuron array with orientation selectivity for encoding and spatial-chromatic processing. Science Advances (2025). DOI: 10.1126/sciadv.adt3584 免责声明：药明康德内容团队专注介绍全球生物医药健康研究进展。本文仅作信息交流之目的，文中观点不代表药明康德立场，亦不代表药明康德支持或反对文中观点。本文也不是治疗方案推荐。如需获得治疗方案指导，请前往正规医院就诊。 更多推荐 点个“在看”再走吧~