CK1α

1. 研究背景分子胶降解剂（Molecular glue degraders, MGs）通过重构E3泛素连接酶与靶蛋白的相互作用界面，诱导形成三元复合物以启动蛋白酶体降解通路，为靶向传统不可成药靶点提供了创新范式。然而，现有研究手段存在显著局限性：化学蛋白质组学与亲和富集质谱技术主要聚焦于终末降解事件，难以动态捕获E3连接酶与底物间的瞬时弱相互作用，导致非降解性新底物（neo-substrates）的系统性漏检，这不仅制约了靶点空间的拓展，更影响对分子胶作用机制的深度解析。尤为突出的是，处于临床研究阶段的分子胶（如DKY709）其底物谱系尚未完全解析，且缺乏高通量解析其诱导的E3连接酶互作组的有效工具，这些瓶颈严重阻碍了新一代降解剂的理性设计。2. 研究目的针对上述科学难题，陈小华/谭敏佳团队在《Angew. Chem. Int. Ed.》发表题为《Crosslinking Profiling of Molecular Glue Degrader-Induced E3 Ligase Interactome to Expand Target Space》的研究，开发了基于基因编码光交联非天然氨基酸（UAA）与质谱蛋白质组学联用的全局交联分析策略。本研究构建了三个递进式研究体系：(1) 通过CRBN底物结合域特定位点的UAA整合，实现在活细胞水平精准捕获分子胶（CC-885、DKY709）诱导的CRBN-底物瞬时互作；(2) 系统性鉴定CRBN降解依赖性与非依赖性新底物（FIZ1、ZFP91等），揭示其底物识别基序并并扩展其靶点空间；(3) 基于结构机制设计新型分子胶降解剂CM-2/CM-3，通过TR-FRET和细胞毒性实验验证其通过重塑CRBN互作网络增强抗肿瘤效能的可行性。该技术为分子胶的机制研究及临床转化提供了高效工具，并为克服“不可成药”靶点难题开辟新路径。 3. 研究结果成果一：CRBN互作网络解析通过UAA介导的光交联捕获技术，揭示了CC-885诱导的CRBN动态互作网络。Western blot与质谱联用技术验证了CRBN-GSPT1复合物的特异性形成，阐明CC-885通过精确调控CRBN构象改变实现GSPT1选择性降解的分子基础，为分子胶的靶向性机制提供了直接实验证据。成果二：DKY709底物谱系拓展结合分子对接与定量质谱分析，不仅验证了DKY709的已知降解靶标，更发现FIZ1作为新型CRBN依赖性降解底物。进一步的蛋白丰度测定和Western blot结果证实，FIZ1降解受DKY709诱导，并依赖CRBN介导的泛素-蛋白酶体途径。该研究拓展了CRBN介导的底物谱，同时也为优化临床候选药物的脱靶效应评估提供了关键数据。成果三：理性药物设计突破基于lenalidomide的构效关系优化，成功设计出CM-2、CM-3系列衍生物。分子对接模拟表明，CM-2和CM-3在CRBN结合口袋中具有更优的配体构象，并通过 TR-FRET实验验证了其较高的CRBN亲和力。此外，在MM.1S细胞中，这些新型降解剂表现出更强的细胞毒性和降解活性，表明其在血液瘤治疗中的潜在应用值。    成果四：降解动力学机制阐明分析了分子胶降解剂CM-2和CM-3诱导的靶蛋白降解机制。Western blot结果表明，ZFP91和FIZ1在CM-2处理后显著降解，而蛋白酶体和NEDD8途径抑制实验进一步确认，该降解依赖于CRBN介导的泛素化过程。此外，时间梯度实验揭示了CM-3诱导GSPT1和CK1α降解的动力学模式，为MG降解剂的作用机理提供了更深入的证据。4. 研究结论本研究创新性地构建了光交联蛋白质组学技术平台，实现了分子胶诱导的E3连接酶互作网络解析，并拓展了其潜在靶点范围，为新型降解剂的设计提供了关键结构信息。基于结构机制设计的CM-2、CM-3系列衍生物，在临床前模型中展现出显著优化的药效学特征。该技术平台不仅为分子胶作用机制研究提供了有力工具，更为突破"不可成药"靶点治疗瓶颈开辟了新途径。研究建立的"靶点发现-机制解析-药物设计"三位一体研究范式，为靶向蛋白降解领域的发展提供了方法论创新。声明：发表/转载本文仅仅是出于传播信息的需要，并不意味着代表本公众号观点或证实其内容的真实性。据此内容作出的任何判断，后果自负。若有侵权，告知必删！长按关注本公众号   粉丝群/投稿/授权/广告等请联系公众号助手 觉得本文好看，请点这里↓

Monte Rosa Therapeutics是一家专注于分子胶降解剂（Molecular glue degrader，MGD）开发的公司，其研发管线聚焦于难成药靶点（GSPT1、VAV1、NEK7）。去年10月，Monte Rosa在BioRxiv上发表了其最新文章“Mining the CRBN Target Space Redefines Rules for Molecular Glue-induced Neosubstrate Recognition”，阐述了他们分子胶降解剂的开发历程。——背景——分子胶降解剂是一种利用细胞内蛋白质降解机制（如泛素-蛋白酶体、溶酶体等）来降解靶标蛋白的分子。目前研究最为深入的分子胶降解剂是以E3泛素连接酶CRBN为基础的分子胶降解剂，这类药物也被称为CRBN调节药物（Cereblon modulating drugs，CELMoDs）。CELMoD与CRBN结合，形成新的二元复合物界面，通过该界面招募新的底物（Neo-substrate）。已知的Neo-substrate有CK1α、GSPT1、IKZF1、IKZF2、WIZ等，这些都是传统意义上的难成药靶蛋白。这些Neo-substrate通过一个G-loop与CRBN/CELMoD结合，G-loop由β-hairpin α-turn构成，在特定位置有一个共同的甘氨酸，因此也被称为β-hairpin G-loop。目前已知数千种人类蛋白都包含这样的结构。鉴于三元复合物界面的简洁性，作者们试图回答两个问题：是否有更多的G-loop蛋白可被CELMoD诱导降解；除了G-loop，CRBN是否还能与其他结构兼容？——NEK7降解剂的发现——在前半部分中，作者通过计算方法发现了人类蛋白质组中存在大量G-loop蛋白，并明确了这些G-loop蛋白可被化合物诱导接近CRBN，但“接近（Proximity）”是蛋白降解的必要不充分条件：以本文中的Cpd1为例，Cpd1可诱导CK1α，NEK7，SCYL1，MNAT1，ASS1，CHD7，PPIL4等多种蛋白接近CRBN（Turbo-ID实验），但仅有CK1α，PDE6D和少量C2H2 ZFs的含量有明显下降。于是作者探究了一个问题：能否通过对分子胶进行化学改造，使得“接近”转变为“降解”。图1. 本文所用到的分子胶在此基础上，作者将目光投向NEK7（一种与 NIMA 相关的丝氨酸 / 苏氨酸激酶，在自身炎症性疾病中具有治疗相关性）。NEK7激酶结构域的N-lobe上存在一个β-hairpin G-loop，与CK1α具有较高相似性（图2）。在TR-FRET， NanoBRET和TurboID实验中，CRBN和Cpd1，NEK7能形成三元复合物，但在CAL51细胞中，Cpd1对NEK7水平无影响。图2. NEK7激酶结构域作者通过TR-FRET，NanoBRET实验筛选了内部化合物库，发现了Cpd5能诱导NEK7与CRBN形成三元络合物，其EC50值与Cpd1相当，但信号强度高于Cpd1。在CAL51细胞中，Cpd5选择性降解NEK7，且降解谱与Cpd1比相当干净（图3）。图3. A. Cpd1降解谱。B. Cpd5 NanoBRET信号强于Cpd1。C.Cpd5降解谱。作者解析了CRBN-Cpd5-NEK7的复合物晶体结构。首先Cpd5的二氢尿嘧啶片段插入CRBN三色氨酸笼中，咪唑并吡啶环以及后续的尾巴朝向溶剂暴露区，负责与NEK7相互作用。NEK7通过G-loop与CRBN/Cpd5复合物结合，其中G-loop位于咪唑并吡啶环附近，G-loop上的G57，L55，L54主链羰基分别与CRBN W386，H357，N351侧链形成氢键。此外G-loop G-5位的丙氨酸A52较小的侧链避免了与化合物形成冲突。最后，苯基磺酰胺部分更接近于NEK7残基的远端，并且与位于相邻的N-lobe上β-链上的R35和E37形成氢键（图4）。图4. 三元复合物晶体结构及详细互作——VAV1降解剂的发现——前面作者通过基于序列的方式，发现了一千多种CRBN潜在新底物。紧接着作者更换策略，通过基于表面的方式，又发现了新的CRBN底物，这些新发现的底物的degron序列与之前的G-loop完全不同。本公众号前文推送的“MaSIF相关工作”是近年来描述蛋白质表面的重要计算工具。值得注意的是，Monte Rosa这篇工作的共同第一作者正是MaSIF的第一作者。本工作采用的表面相似性算法来源于MaSIF。从CRBN-CC90009-GSPT1三元复合物结构出发，首先提取GSPT1中与参与复合物形成的界面，然后在蛋白质组中搜寻相似的界面。作者将已知的G-loop的蛋白排除在外，希望寻找到新颖的靶标（图5A）。VAV1是B细胞和T细胞受体信号传导的关键介质，且不含G-loop。VAV1表面可划分出27168个patch，将这些patch逐一与GSPT1 degron surface进行匹配，得到较为相似的patch。然后通过蛋白-蛋白对接，过滤掉与CRBN界面有冲突的patch，最后确定VAV1的C末端SH3结构域（SH3c），与GSPT1表面在与CC-90009形成的复合物中与CRBN接触的表面有极高的相似性，且SH3c结构域与GSPT1或其G-loop没有潜在的结构同源性。图5. A.基于表面的CRBN Neo-substrate发现过程 B.VAV1 SH3c表面与GSPT1 degron比较随后作者筛选了内部化合物库，发现Cpd6能够专一地诱导CRBN与VAV1 SH3c形成三元复合物（图6）。图6. Cpd6能够专一地诱导CRBN与VAV1 SH3c形成三元复合物最后，作者解析了VAV1-Cpd6-CRBN的三元复合物结构（图7）。VAV1 SH3c 结构域中的预测参与形成复合物的patch由两个色氨酸残基 W820 和 W831 以及 RT 环的顶端区域（aa797 – 801）形成。图7. VAV1-Cpd6-CRBN的三元复合物结构及关键相互作用——小结——通过计算工具，该工作系统性的发掘了1633种潜在的CRBN新底物，且在已知的β-hairpin G-loop motif之外，发现了新的helical G-loop。（之前的工作已经发现含C2H2锌指结构域是CRBN的潜在底物）该工作进一步拓宽了CRBN底物范围，包含不同功能、结构的蛋白质。通过实验验证，该工作确证了21种含有β-hairpin G-loop或 helical G-loop的新底物，大大拓宽了CRBN底物。不同的CELMoDS，可实现对底物的精准降解，表明基于CRBN的分子胶降解剂大有可为。G-loop motif的发现是基于序列的发掘方法的胜利。回归本质，CELMoDs诱导三元复合物形成这一过程事实上是Neo-substrate的界面与CELMoD-CRBN二元复合物新界面之间的电荷、形状、亲/疏水等的匹配。因此，基于表面的方法使作者成功发现了VAV1也是CRBN的底物，尽管VAV1与GSPT1序列相似性或结构同源性上都很低。该发现同样凸显了CRBN参与PPI相互作用的界面的非凡可塑性（N351、H357、W400），这些位点既能与G-loop相容，也与VAV1的RT-loop相容。最后，Monte Rosa的工作展示了计算工具在分子胶开发中的非凡潜力。参考文献：[1] Petzold, G.; Gainza, P.; Annunziato, S.; Lamberto, I.; Trenh, P.; McAllister, L.; Demarco, B.; Schwander, L.; Bunker, R. D.; Zlotosch, M.; et al. Mining the CRBN Target Space Redefines Rules for Molecular Glue-induced Neosubstrate Recognition. bioRxiv 2024, 2024.2010.2007.616933. DOI: 10.1101/2024.10.07.616933.作者：任宇浩审稿：王瀚平  编辑：郭   政版权声明：本文内容及图片，如有侵权请联系删除。免责声明：本文内容仅作信息交流学习，并不反映任何意见及观点。往期推荐乐威医药亮相2025 DCAT Week乐威医药公益3.12植树行动乐威医药获2024年度EcoVadis承诺奖牌

Monte Rosa Therapeutics是一家专注于分子胶降解剂（Molecular glue degrader，MGD）开发的公司，其研发管线聚焦于难成药靶点（GSPT1、VAV1、NEK7）。去年10月，Monte Rosa在BioRxiv上发表了其最新文章“Mining the CRBN Target Space Redefines Rules for Molecular Glue-induced Neosubstrate Recognition”，阐述了他们分子胶降解剂的开发历程。——背景——分子胶降解剂是一种利用细胞内蛋白质降解机制（如泛素-蛋白酶体、溶酶体等）来降解靶标蛋白的分子。目前研究最为深入的分子胶降解剂是以E3泛素连接酶CRBN为基础的分子胶降解剂，这类药物也被称为CRBN调节药物（Cereblon modulating drugs，CELMoDs）。CELMoD与CRBN结合，形成新的二元复合物界面，通过该界面招募新的底物（Neo-substrate）。已知的Neo-substrate有CK1α、GSPT1、IKZF1、IKZF2、WIZ等，这些都是传统意义上的难成药靶蛋白。这些Neo-substrate通过一个G-loop与CRBN/CELMoD结合，G-loop由β-hairpin α-turn构成，在特定位置有一个共同的甘氨酸，因此也被称为β-hairpin G-loop。目前已知数千种人类蛋白都包含这样的结构。鉴于三元复合物界面的简洁性，作者们试图回答两个问题：是否有更多的G-loop蛋白可被CELMoD诱导降解；除了G-loop，CRBN是否还能与其他结构兼容？——NEK7降解剂的发现——在前半部分中，作者通过计算方法发现了人类蛋白质组中存在大量G-loop蛋白，并明确了这些G-loop蛋白可被化合物诱导接近CRBN，但“接近（Proximity）”是蛋白降解的必要不充分条件：以本文中的Cpd1为例，Cpd1可诱导CK1α，NEK7，SCYL1，MNAT1，ASS1，CHD7，PPIL4等多种蛋白接近CRBN（Turbo-ID实验），但仅有CK1α，PDE6D和少量C2H2 ZFs的含量有明显下降。于是作者探究了一个问题：能否通过对分子胶进行化学改造，使得“接近”转变为“降解”。图1. 本文所用到的分子胶在此基础上，作者将目光投向NEK7（一种与 NIMA 相关的丝氨酸 / 苏氨酸激酶，在自身炎症性疾病中具有治疗相关性）。NEK7激酶结构域的N-lobe上存在一个β-hairpin G-loop，与CK1α具有较高相似性（图2）。在TR-FRET， NanoBRET和TurboID实验中，CRBN和Cpd1，NEK7能形成三元复合物，但在CAL51细胞中，Cpd1对NEK7水平无影响。图2. NEK7激酶结构域作者通过TR-FRET，NanoBRET实验筛选了内部化合物库，发现了Cpd5能诱导NEK7与CRBN形成三元络合物，其EC50值与Cpd1相当，但信号强度高于Cpd1。在CAL51细胞中，Cpd5选择性降解NEK7，且降解谱与Cpd1比相当干净（图3）。图3. A. Cpd1降解谱。B. Cpd5 NanoBRET信号强于Cpd1。C.Cpd5降解谱。作者解析了CRBN-Cpd5-NEK7的复合物晶体结构。首先Cpd5的二氢尿嘧啶片段插入CRBN三色氨酸笼中，咪唑并吡啶环以及后续的尾巴朝向溶剂暴露区，负责与NEK7相互作用。NEK7通过G-loop与CRBN/Cpd5复合物结合，其中G-loop位于咪唑并吡啶环附近，G-loop上的G57，L55，L54主链羰基分别与CRBN W386，H357，N351侧链形成氢键。此外G-loop G-5位的丙氨酸A52较小的侧链避免了与化合物形成冲突。最后，苯基磺酰胺部分更接近于NEK7残基的远端，并且与位于相邻的N-lobe上β-链上的R35和E37形成氢键（图4）。图4. 三元复合物晶体结构及详细互作——VAV1降解剂的发现——前面作者通过基于序列的方式，发现了一千多种CRBN潜在新底物。紧接着作者更换策略，通过基于表面的方式，又发现了新的CRBN底物，这些新发现的底物的degron序列与之前的G-loop完全不同。本公众号前文推送的“MaSIF相关工作”是近年来描述蛋白质表面的重要计算工具。值得注意的是，Monte Rosa这篇工作的共同第一作者正是MaSIF的第一作者。本工作采用的表面相似性算法来源于MaSIF。从CRBN-CC90009-GSPT1三元复合物结构出发，首先提取GSPT1中与参与复合物形成的界面，然后在蛋白质组中搜寻相似的界面。作者将已知的G-loop的蛋白排除在外，希望寻找到新颖的靶标（图5A）。VAV1是B细胞和T细胞受体信号传导的关键介质，且不含G-loop。VAV1表面可划分出27168个patch，将这些patch逐一与GSPT1 degron surface进行匹配，得到较为相似的patch。然后通过蛋白-蛋白对接，过滤掉与CRBN界面有冲突的patch，最后确定VAV1的C末端SH3结构域（SH3c），与GSPT1表面在与CC-90009形成的复合物中与CRBN接触的表面有极高的相似性，且SH3c结构域与GSPT1或其G-loop没有潜在的结构同源性。图5. A.基于表面的CRBN Neo-substrate发现过程 B.VAV1 SH3c表面与GSPT1 degron比较随后作者筛选了内部化合物库，发现Cpd6能够专一地诱导CRBN与VAV1 SH3c形成三元复合物（图6）。图6. Cpd6能够专一地诱导CRBN与VAV1 SH3c形成三元复合物最后，作者解析了VAV1-Cpd6-CRBN的三元复合物结构（图7）。VAV1 SH3c 结构域中的预测参与形成复合物的patch由两个色氨酸残基 W820 和 W831 以及 RT 环的顶端区域（aa797 – 801）形成。图7. VAV1-Cpd6-CRBN的三元复合物结构及关键相互作用——小结——通过计算工具，该工作系统性的发掘了1633种潜在的CRBN新底物，且在已知的β-hairpin G-loop motif之外，发现了新的helical G-loop。（之前的工作已经发现含C2H2锌指结构域是CRBN的潜在底物）该工作进一步拓宽了CRBN底物范围，包含不同功能、结构的蛋白质。通过实验验证，该工作确证了21种含有β-hairpin G-loop或 helical G-loop的新底物，大大拓宽了CRBN底物。不同的CELMoDS，可实现对底物的精准降解，表明基于CRBN的分子胶降解剂大有可为。G-loop motif的发现是基于序列的发掘方法的胜利。回归本质，CELMoDs诱导三元复合物形成这一过程事实上是Neo-substrate的界面与CELMoD-CRBN二元复合物新界面之间的电荷、形状、亲/疏水等的匹配。因此，基于表面的方法使作者成功发现了VAV1也是CRBN的底物，尽管VAV1与GSPT1序列相似性或结构同源性上都很低。该发现同样凸显了CRBN参与PPI相互作用的界面的非凡可塑性（N351、H357、W400），这些位点既能与G-loop相容，也与VAV1的RT-loop相容。最后，Monte Rosa的工作展示了计算工具在分子胶开发中的非凡潜力。参考文献：[1] Petzold, G.; Gainza, P.; Annunziato, S.; Lamberto, I.; Trenh, P.; McAllister, L.; Demarco, B.; Schwander, L.; Bunker, R. D.; Zlotosch, M.; et al. Mining the CRBN Target Space Redefines Rules for Molecular Glue-induced Neosubstrate Recognition. bioRxiv 2024, 2024.2010.2007.616933. DOI: 10.1101/2024.10.07.616933.作者：任宇浩审稿：王瀚平  编辑：郭   政