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通过对 5'端帽子结构进行修饰，会改变 mRNA 的稳定性和翻译效率，使得 mRNA 增加更多的功能，例如，将荧光染料连接到帽子结构上面，使得 mRNA 变得可视化。那么，如何才能合成 5'端携带各种化学修饰帽子的 mRNA？当前的加帽方式分为共转录加帽和转录后酶法加帽。共转录加帽利用 T7 RNA 聚合酶将二核苷酸或者三核苷酸帽子类似物直接添加到 5'末端，从头合成 mRNA。考虑到对 T7 RNA 聚合酶亲和力的影响，一般来说，常见的帽子类似物在合成的时候并不会添加额外的化学修饰。酶法加帽利用加帽酶将 GTP 连接到 RNA 分子 5'末端。如果能够找到一种加帽酶可以将各种 GTP 类似物（碱基或者核糖携带化学修饰）高效插入 RNA 分子 5'末端，那么便可以合成出各种化学修饰的 5'帽子结构。图 1：碱基和核糖具有各种化学修饰的 GTP 类似物。实际上，早有研究发现来自小球藻病毒（Chlorella virus）的加帽酶能够用 GTP 类似物进行 5'末端加帽反应，只是受限于 GTP 类似物的种类和加帽效率。我们在常规酶法加帽中会用到牛痘加帽酶（VCE），涉及 3 个过程：第一，将 RNA 5'端的三磷酸水解变为二磷酸；第二，将 GMP 从 GTP 中转移到二磷酸 RNA 分子上，形成 Gppp-RNA；以 SAM 作为甲基供体，将鸟嘌呤 N7 为甲基化，形成 m7G-ppp-RNA。也有研究发现牛痘加帽酶能够在 RNA 5'末端引入 GTP 类似物以捕获帽子结合蛋白，例如荧光染料或者生物素。然而，一直以来，并未有人系统性地比较过牛痘加帽酶利用各个 GTP 类似物进行加帽反应的能力。图 2：牛痘加帽酶将 GMP（来自 GTP）连接到二磷酸 RNA 分子 5'末端，以 SAM 作为甲基供体，将鸟嘌呤 N7 为甲基化，形成 m7G-ppp-RNA。2023 年 2 月 3 号，京都大学 Hirohisa Ohno 等人在 Nucleic Acids Research 上发表文章：Versatile strategy using vaccinia virus-capping enzyme to synthesize functional 5′ cap-modified mRNAs，他们利用牛痘加帽酶，以各种化学修饰 GTP 类似物为底物，合成携带各种化学修饰帽子的 mRNA。以 GTP 作为基准，比较牛痘加帽酶对各种 GTP 类似物的加帽效率和 N7 甲基化效率。以 m7Gppp-RNA 为基准，比较携带各种化学修饰帽子结构的 mRNA 在对去帽酶、翻译效率以及细胞内稳定性的差异。结果发现，牛痘加帽酶利用某些 GTP 类似物进行加帽反应，提升 mRNA 翻译效率，并且还可以偶联生物标记分子，使得 mRNA 具有更多的功能性，为 RNA 领域的基础研究提供更加有力的工具。接下来，我们将从文章结论中重点总结影响牛痘加帽酶活性以及 mRNA 翻译效率的 GTP 化学修饰规律。👀   GTP 类似物影响牛痘加帽酶活性研究人员利用牛痘加帽酶将各种化学修饰 GTP 类似物插入到短链 RNA(11nt) 5'末端，并且，在 SAM 最为甲基供体的情况下，牛痘加帽酶还会将鸟嘌呤 N7 位甲基化。通过变性凝胶电泳区分加帽和未加帽 RNA，从而计算出加帽效率。利用 LC-MS 可分析鸟嘌呤 N7 位甲基化效率。图 3：牛痘加帽酶能够将修饰 GTP 类似物插入到 RNA 5'末端。   鸟苷酸转移酶活性在面对大多数 GTP 类似物时，牛痘加帽酶表现出的加帽效率同天然底物 GTP 是类似的。通过延长反应时间或者增加 GTP 类似物浓度或者牛痘加帽酶浓度，可以提升牛痘加帽酶对某些 GTP 类似物的加帽效率。当然，牛痘加帽酶对于一些 GTP 类似物只有极低的加帽效率。总之，试验结果显示，牛痘加帽酶确实可以将各种化学修饰的 GTP 类似物插入到 RNA 5'末端。GTP 类似物上碱基的修饰对于牛痘加帽酶活性带来的影响要远大于核糖上的修饰。根据 GTP 和牛痘加帽酶相互作用的晶体结构，GTP 鸟嘌呤碱基与牛痘加帽酶氨基酸残基形成氢键，从而被识别，例如，O6 与 Lys350，N7 与 Lys350，N2 与 Asp390/Thr239 分别形成氢键。当碱基上的修饰不影响与牛痘加帽酶识别残基形成氢键时，例如，m1GTP，m6GTP，CI6GTP，加帽效率虽然有降低，但是依然可以将这些 GTP 类似物插入到 RNA 5'末端。然而，如果碱基上的化学修饰干扰与牛痘加帽酶识别残基形成氢键时，加帽反应效率急剧下降或者甚至无法完成加帽，例如，deazaGTP，thienoGTP，isoGTP，ATP，a2ATP，a2m6ATP，XTP。图 4：牛痘加帽酶与 GTP 或者 GTP 类似物之间的相互作用。核糖上面的 2'-OH 发生修饰会导致牛痘加帽酶的加帽效率发生下降，例如，fGTP,Om2GTP,N32'GTP。相反，如果核糖 3'-OH 发生修饰，对于牛痘加酶的加帽效率并没有太大影响（与天然底物 GTP 类似）例如，Om3'GTP，NH23'GTP，N33'dGTP，Opp3'GTP。从 VCE-GTP 晶体结构来看，核糖 2'-OH 与牛痘加帽酶 Glu303 会形成氢键，但是，核糖 3'-OH 是自由的。修饰或者不修饰的 ddGTP 均无法进行加帽反应，这可能是由于双脱氧核苷酸易于发生去嘌呤反应，即便完成加帽和 N7 甲基化，后续也可能将 m7G 移除，从而导致无法生产加帽 RNA。此外，GTP α磷酸基团上的化学修饰对于牛痘加帽酶的加帽效率没有影响，因此，可在此位置引入其他的化学修饰位点。   N7 甲基转移酶活性对于碱基上携带修饰的 GTP 类似物来说，例如，m1GTP，m6GTP，CI6GTP，检测不到 N7 甲基化位点。相反，ITP 的牛痘加帽酶甲基化效率和天然底物 GTP 是类似的。大部分核糖上修饰的 GTP 类似物也具有高效的 N7 甲基化效率。磷酸基团上携带修饰的 GTPαS 也具有极低的 N7 甲基化效率。也就是说，除了天然底物 GTP，牛痘加酶的 N7 甲基化酶活性（MTase）还存在更多的兼容性底物。ITP 能够被牛痘加帽酶完全甲基化，而 CI6GTP 无法被甲基化，这说明 Watson-Crick 边缘位置上 N1 和 O6 对于牛痘加帽酶识别碱基非常重要。m6GTP 也无法被甲基化，这很可能是 LC-MS 无法区分 m6G 和 m7G 导致的。对于核糖上发生修饰的 GTP 类似物来说，牛痘加帽酶甲基化效率普遍较高。与加帽酶活性相反，甲基转移酶活性对于 2'OH 上的化学修饰要比 3'-OH 容忍度更高。此外，GTP 类似物α磷酸基团对于甲基转移活性也非常重要，因为 GTPαS N7 位置上甲基化效率很低。👀   修饰帽子影响 RNA 对去帽酶的敏感性DCP2（来自于酵母）能够水解 Cap-RNA，释放出 m7G-二磷酸，5'p-RNA 会被 XRN1 外切核酸酶沿着 5'-3'方向降解。DCPS(来自于人类)会α磷酸和β磷酸位置水解 Cap-RNA。化学修饰帽子-mRNA 对于这两种去帽酶的敏感性会发生变化。相比于天然的 m7G-RNA 来说，去帽酶对于有些修饰帽子-RNA 会变得更不容易水解，而对另外一些修饰帽子-RNA 会变得更加容易水解。因此，帽子结构上的化学修饰会改变 RNA 对去帽酶的敏感性。图 5：修饰帽子-RNA 对于去帽酶的敏感性。👀   修饰帽子影响 RNA 细胞翻译效率相比于传统的帽子结构来说，修饰帽子-RNA 在细胞中的翻译效率会发生增强或者减弱。而且，在转染 24h 或者 48h 时，某些修饰帽子-RNA 依然具有很高的翻译活性。值得注意的是在所有测试的修饰帽子结构中，转染 mRNA 的蛋白表达衰减速率或者 mRNA 降解速率并没有显著差异，也就是说修饰帽子-RNA 在细胞中的稳定性没有差异。修饰帽子-RNA 细胞内翻译效率和其对于去帽酶的敏感性之间并不存在明显的联系。有意思的是，m7GαS-RNA 的翻译效率有轻微提升，但是，其 N7 位只发生极弱的甲基化，这可能是由于 m7GαS-RNA 进入细胞后发生了 N7 甲基化或者是因为 eIF4E 识别没有 N7 甲基化的帽子（GTPαS γ位置上的磷酸能够提升帽子对于 eIF4E 的亲和力）。有几个修饰帽子结构没有任何翻译活性，例如,m1G，m7ITP，m7Opp3'G，但是，m1G 或者 m7ITP 要比不加帽 RNA 更加稳定，因此这些修饰帽子可以用来保护 non-messenger RNA 的末端。图 6:化学修饰-RNA 转染细胞后的翻译水平。图 7：化学修饰-RNA 在细胞蛋白表达水平或者细胞内残余 RNA 随时间变化的曲线图。👀   修饰帽子偶联生物标记分子某些 GTP 类似物携带功能基团，例如，氨基酸残基，叠氮化物，炔丙基等，这些功能基团能够共价连接生物标记分子，例如蛋白或者核酸，从而合成一些功能化的 mRNA，例如，将生物素或者荧光染料（AF647）引入到叠氮化物修饰的帽子-RNA 上面。图 8：利用含叠氮修饰的 Cap-RNA 进行生物标记分子的偶联。👀   总结如果采用共转录的方式合成各种修饰帽子-RNA，那么需要合成修饰二核苷酸或者三核苷酸帽子类似物，难度无疑是巨大的。但是，这篇文章证实利用牛痘加帽酶可将各种修饰 GTP 类似物加入到 RNA 5'末端，这些修饰 GTP 类似物是市场上很容易获得的原料，无需用到特制的修饰二核苷酸或者三核苷酸帽子类似物。通过这些修饰 GTP 类似物合成的帽子结构，不仅可以改善 RNA 稳定性和翻译效率，还能够将生物标记分子偶联到修饰帽子上，从而生成功能化的 RNA，为 RNA 领域的基础研究提供更多有力的工具。在抗体圈微信公众号回复“JPM23”可下载60 家药企PPT合集。识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。