FADD

导语 近日，三生国健自主研发的TL1A单克隆抗体（研发代号：SSGJ-627）临床试验申请获国家药品监督管理局受理，成为国内首个申报临床试验的国产TL1A单抗。 目前，全球范围内尚未有针对TL1A的药物获得批准上市，而正在进行临床试验的同类候选药物主要由国外制药公司研发。作为国内国内自免生物药的生力军，三生国健率先在中国市场上对TL1A靶点展开了临床研究，开创了这一领域的先河。 TL1A/DR3概述 TL1A（TNF样配体1A）也称为TNFSF15，是肿瘤坏死因子家族成员。 TL1A 是一种 2 型跨膜蛋白，可通过与 TNF 同源结构域 (THD) 相互作用自组装成稳定的三聚体。 它在不同的免疫细胞中表达，如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、T细胞，以及非免疫细胞，例如滑膜成纤维细胞和内皮细胞中表达。 TL1A通过与死亡受体3（DR3）结合并激活下游信号传导，然后调节效应细胞的增殖、激活、凋亡以及细胞因子、趋化因子的产生，参与先天和适应性免疫稳态的维护。 研究发现，TL1A在自免疫疾病中异常表达，并参与类风湿性关节炎、银屑病和炎症性肠病等自身免疫性疾病。 TL1A因其独特的作用机制在炎症性反应等方面发挥重要作用。目前，TL1A已成为溃疡性结肠炎、克罗恩病等疾病的新靶点。 TL1A/DR3信号通路 DR3是I型膜蛋白，包含四个半胱氨酸残基、两个潜在的N连接糖基化位点、一个跨膜结构域和一个带有死亡结构域 (DD)的细胞质结构域。 sTL1A/DR3 相互作用可以触发两种不同的信号通路，分别引起炎症和细胞凋亡。 首先，DR3 的死亡结构域与细胞质中的接头蛋白 TNFR 相关死亡结构域蛋白 (TRADD) 结合，然后招募 TNFR 相关因子 2 (TRAF2) 和受体相互作用蛋白 1 (RIP1) 。这些复合物激活 MAPK（ERK、p38 和 JNK）、NF-κB 和效应激酶 PI3K 信号传导 。最后，激活的信号调节促炎基因的表达并参与免疫相关疾病的发生。 TRADD 与 Fas 相关死亡结构域 (FADD) 和 RIP3 结合，然后激活半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-8 (caspase-8) 形成复合物，进一步激活下游 caspase 通路（例如 caspase-3 和 -7）和诱导细胞凋亡。 当 caspase-8 活性被阻断时，FADD、RIP3、RIP1 和下游效应分子MLKL的组合在磷酸化后形成胞质“坏死体”复合物。然后，MLKL 寡聚到细胞膜上，并导致坏死性细胞死亡，这是一种伴随强烈炎症的细胞死亡形式 。 更多的证据表明，sTL1A 与 DR3 的连接优先诱导淋巴细胞的促炎途径，而不是凋亡。 图1：TL1A/DR3 启动的信号转导 （TL1A 与受体 DR3 结合并激活 TRADD 通路。该复合物通过调节TRAF2、RIP1、PI3K、MAPKs、NF-κB等下游通路发挥促炎作用，进而调节细胞因子、趋化因子的分泌。TL1A/DR3 通过 FADD、RIP3、Caspase-8/-3/-7 途径参与促进细胞凋亡和坏死性细胞死亡。NF-κB可以激活c-IAP蛋白，从而负向调节细胞凋亡。） TL1A刺激TH1和TH17途径，这些途径与肠道炎症和纤维化的部位和严重程度有关。此外，TL1A还可以激活成纤维细胞，这些细胞是纤维化的主要来源。因此，TL1A是一种调节粘膜免疫和纤维化的重要因子。 炎症性肠病（IBD） 炎症性肠病（IBD）包括溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD），是一组慢性炎症性肠道疾病，其发病机制与易感基因、免疫系统失调和环境因素有关。 TNF被认为是IBD发病机制中的促炎细胞因子，可刺激急性期时的反应，促进IL-1和IL-6的分泌，增加粘附分子的表达。研究发现，活动期IBD患者的血液、上皮组织和粪便中TNF-α显著升高，其水平与CD患者的临床疾病活动性相关。通过抗TNF-α单克隆抗体阻断TNF-α信号已成为中重度难治性IBD患者的重要治疗方法。 TNF家族成员TL1A也被发现是肠道炎症的关键介质，在IBD患者中水平也升高。TL1A主要通过结合死亡受体3（DR3）发挥其功能，TL1A还可以协同促进IL-4、IL-12和IL-23的产生，并通过Th1、Th2和Th17细胞增加DR3的表达，以促进炎症。 吉满生物根据市场需求和研究现状，推出TL1A/DR3稳定过表达细胞系/报告基因检测细胞系/抗体/蛋白相关产品及服务（详细数据见文末），可用于抗体筛选、表征、一致性评价, 充分满足药物研发的需求，助力抗体药物临床申报。（咨询吉满客服联系同微信：18916119826） 靶向TL1A/DR3药物研发进展 目前已有多家药企布局TL1A/DR3靶点，在研药物包括单抗和双抗，如PRA023、RVT-3101、和PF-07261271等，主要针对克罗恩病、溃疡性结肠炎等IBD疾病。全球尚无已上市的TL1A靶点药物；DR3靶点相关药物全球进展较慢，几款药物均处于早期临床阶段。 2023年4月，默沙东以108亿美元收购Prometheus Biosciences获得这款TL1A抑制剂MK-7240。目前MK-7240已在美启动3期临床研究，评价该产品治疗中重度活动性溃疡性结肠炎的疗效和安全性。 2024年2月，CDE官网公示，默沙东（MSD）申报的MK-7240获得临床试验默示许可，拟开发治疗中度至重度活动性溃疡性结肠炎，正在国内开展2项临床研究。 2023年10月，赛诺菲以超15亿美元与Teva就其TL1A单抗TEV574达成合作。2024年12月17日，双方共同宣布2b期RELIEVE UCCD研究达成主要终点。研究结果显示duvakitug在治疗中重度溃疡性结肠炎（UC）和克罗恩病（CD）患者中显著提高了临床缓解率，展现出同类最佳疗法的潜力。 近日，三生国健自主研发的TL1A单克隆抗体（研发代号：SSGJ-627）临床试验申请获国家药品监督管理局受理，成为国内首个申报临床试验的国产TL1A单抗。SSGJ-627 注射液是三生国健创新研发，拥有自主知识产权的重组抗 TL1A 人源化单克隆抗体。 吉满生物 TL1A阻断剂目前已经成为一种治疗炎症性和纤维化疾病的潜在新疗法。为助力药物研发，吉满生物自主设计并开发了一系列稳定表达TL1A/DR3细胞系、报告基因检测细胞系以及一系列高特异性、高灵敏性单克隆抗体。 除此之外，吉满生物还可提供高活性TL1A重组蛋白，可满足客户在动物免疫、抗体筛选以及表位鉴定等不同场景中的需求，所有产品均已通过严格的质量监测。 产品列表 数据展示 细胞产品验证数据（部分） GM-C30290：H_TNFRSF25(DR3) Reporter Jurkat Cell Line 使用Human TL1A Protein激活验证结果 使用Human TL1A Protein激活后再用Anti-H_TNFSF15(TL1A)（PRA-023）block验证 使用Anti-TNFRSF25(DR3) hIgG1 Antibody(PTX-35)  流式验证结果 Human TL1A Protein 稳定性验证结果 GM-C19170：H_TNFSF15(TL1A) CHO-K1 Cell Line 使用Anti-H_TNFSF15(TL1A) hIgG1 Antibody(Tulisokibart)流式验证结果 蛋白产品数据展示 GM-84079RP：Human TL1A Protein; His Tag On SDS-PAGE under reducing (R) condition. The gel was stained overnight with Coomassie Blue. The purity of the protein is greater than 90%. Human TL1A Protein; His Tag (Catalog#GM-84079RP) was immobilized at 5 μg/ml (100 μL/well). Increasing concentrations of Anti-H_TNFSF15(TL1A) hIgG1 Antibody (Tulisokibart、PRA-023) (Catalog#GM-58915AB) were added. Human TL1A Protein; His Tag (Catalog#GM-84079RP) was added into H_TNFRSF25(DR3) Reporter Jurkat Cell Line (Catalog#GM-C30290), and stimulates TL1A/DR3 signals. Neutralization assay shows that the stimulate effect of 10 ng/mL Human TL1A Protein; His Tag (Catalog#GM-84079RP)was inhibited by increasing concentration of Anti-H_TNFSF15(TL1A) hIgG1 Antibody (Tulisokibart、PRA-023)(Catalog#GM-58915AB).  GM-84080RP：Cynomolgus TL1A Protein; His Tag On SDS-PAGE under reducing (R) condition. The gel was stained overnight with Coomassie Blue. The purity of the protein is greater than 90%. Cynomolgus TL1A Protein; His Tag (Catalog#GM-84080RP) was immobilized at 5 μg/ml (100 μL/well). Increasing concentrations of Monoclonal Anti-H_TNFSF15(TL1A) hIgG1 Antibody(Tulisokibart、PRA-023) (Catalog#GM-58915AB) were added. Cynomolgus TL1A Protein; His Tag (Catalog#GM-84080RP) was added to H_TNFSF15(TL1A) Reporter Cell Line (Catalog#GM-C30289), and stimulates TL1A/DR3 signals. 联系我们 吉满生物助力药物研发，紧随前沿靶点资讯，储备几百株现货细胞，覆盖GPCR、细胞因子、免疫检查点、TAA等多领域，截止当前已布局近300个热门靶向药靶点，1000余株细胞系，旨在助力、加速大分子早期研发，做到进口细胞的国产替代。同时可根据客户需求提供细胞系服务。 扫码咨询 扫码找现货

1.介绍 哺乳动物的组织由许多不同类型的细胞构成，形成各种器官。它们都源自同一个受精卵，然后分化成具有截然不同特性的细胞，使用相同的遗传信息，却走向非常不同的命运。一个多世纪前，科学家们开始从外植组织中分离细胞。在第1章中，我们简要讨论了使细胞培养成为研究工具和生产宿主的促进性进展，包括培养基的开发及其膜灭菌和细胞胰蛋白酶化和传代。大多数从组织中生长出来的细胞只能被培养几代，但最终有一些细胞成功建立，可以传代许多代。在冷冻保存方法建立后，细胞可以被“储存”以备将来使用，这允许产生对研究和生产至关重要的可复制结果。在细胞培养的早期几十年中建立的大多数细胞都是从肿瘤中衍生的。这些细胞在形态上与从正常组织中生长出来的原代细胞不同。即使是那些最初从正常组织中分离出来并且可以连续传代的细胞，看起来也更像来自肿瘤的细胞。随着对生长因子和细胞外基质的认识的增加，从20世纪70年代开始培养正常和分化的细胞。成体干细胞的分离以及随后小鼠胚胎多能干细胞的分离，与更多生长因子和细胞因子的广泛可用性，开始改变细胞培养的研究格局。20世纪90年代大量生产治疗蛋白的需求改变了我们对细胞的看法。它们现在是生物制造的主要工作马。本章将讨论影响细胞生长和细胞生产蛋白产品能力的细胞结构组成部分的关键方面。 2.组织细胞及其分离 2.1.细胞系、细胞株和衰老 从哺乳动物组织中分离出的绝大多数细胞都是锚定依赖性的，这意味着它们需要表面粘附才能增殖。它们通常通过组织（图2.1）的酶解离来分离。解离后去除未解离的块状物，将细胞种植在与培养基覆盖的兼容表面上。培养基悬浮液中的细胞团附着在表面，并逐渐有一些细胞从组织团中生长出来。随后，细胞延伸其体长，展开，并开始增殖。当它们开始覆盖整个表面积时，生长速率减慢，最终在表面上形成一层“单层”细胞。达到融合后，细胞分裂停止。虽然相邻细胞的细胞体可能会相互交叉，但它们的细胞核永远不会重叠。这被称为细胞生长的接触抑制。接触抑制的细胞可以通过胰蛋白酶处理从表面解离。在更大的表面上重新种植并提供新鲜培养基后，细胞生长恢复，直到再次达到融合。这个过程可以重复以扩大种群。每次解离和扩展称为“传代”。每个传代中发生的细胞倍增数量由分裂比决定，或每次传代中扩展的表面积比（见参考文献1以供进一步阅读）。 图 2.1. 正常二倍体细胞培养中的锚定依赖性和接触抑制。 直接从组织中分离的细胞称为原代细胞（面板2.1）。大多数原代细胞在非常少量的细胞倍增后停止生长。这对于从特殊组织中分离的细胞尤其如此，如肝脏和卵巢。它们通常很快在培养中失去其典型的组织相关特性。体内大多数组织中的细胞是静止的，这意味着它们不分裂（面板2.2）。静止状态不仅仅是由于缺乏生长所需条件的被动结果，例如缺少必需的营养物质。相反，静止状态是由生物体的调节强加于细胞的。例如，我们体内的干细胞大部分时间处于静止状态，这是通过细胞周期调节，通过细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、转录因子和肿瘤抑制因子。从组织外植中生长出来的细胞已经经历了细胞生长控制机制的变化，使其能够在培养中增殖。 在某些情况下，从分离的组织中生长出来的细胞可以连续传代并在许多传代中仍然保持正常的形态和细胞行为。它们甚至可以在液氮中冷冻保存，并被“储存”以备将来的研究、分发或生产目的。然而，这种反复的传代和细胞培养中的扩展不能无限期地继续。最终，会达到衰老。在衰老之前，这些细胞在形态上是正常的。它们的核型是二倍体，即具有两套正常染色体。几乎所有来自哺乳动物组织的正常的二倍体细胞在培养中的寿命都是有限的，胚胎干细胞和诱导多能干细胞除外。与组织细胞相比，癌细胞在体内增殖。它们通常携带多种突变，使它们能够绕过通常会保持它们处于静止状态的生长控制机制。因此，它们更容易从肿瘤组织中分离出来进行体外培养。有时，也可以通过病毒或癌基因转化的“永生化”从正常组织中建立细胞系。那些可以无衰老地连续生长的细胞通常与它们的正常对应物没有相同的形态。它们的核型不是二倍体，它们的增长不受接触抑制。在充足的营养物质和生长因子供应下，它们甚至可以相互叠加形成多层细胞。这样的细胞包括常用的工业细胞系，如来自中国仓鼠卵巢的CHO细胞，来自绿猴肾的Vero细胞，以及人类肾脏细胞HEK293。 在没有使用特殊培养条件来丰富分化细胞的情况下，成纤维细胞是从正常哺乳动物组织中分离出的主要细胞类型。从小鼠胚胎中分离出的成纤维细胞可以在体外培养大约60次倍增（图2.2）。随着这一极限的临近，细胞开始未能达到融合，并最终停止生长。这种衰老，或者说这些细胞增殖潜力的限制，被称为“海夫利克现象”。这是所有正常二倍体细胞（再次，胚胎干细胞和诱导多能干细胞除外）的共同现象，它们来自脊椎动物。 图 2.2. 不同细胞类型的寿命和增长率。 在半个世纪前进行的一项历史性实验中，将小鼠成纤维细胞持续传代超越危机，产生了一小部分幸存者。这些细胞最终生长、扩展，并且可以在体外无限制地连续培养。它们被命名为3T3，因为细胞每三天传代一次，每次在20平方厘米的培养皿中扩展3×10^5个细胞。这些细胞看起来正常，并在典型的培养条件下受到接触抑制。然而，与危机前的鼠成纤维细胞不同，3T3细胞具有异常的非二倍体染色体组。那些屈服于海夫利克限制的细胞（例如，那些是二倍体并且有有限寿命的细胞）被称为“细胞株”。可以在培养中无限生长的细胞被称为“细胞系”，包括那些在危机过后重新建立的，直接来自正常或肿瘤组织。一般来说，细胞系是非整倍体的（没有正常的染色体组）。 因此，受衰老影响的细胞似乎“计数”它们的倍增次数。衰老是由细胞事件调节的，通常被认为与衰老有关。它本质上是一种生长停滞，但与静止状态不同。处于静止状态的细胞可以恢复到它们的生长阶段，但进入衰老的细胞经历了不可逆的生长停滞。衰老也可能因应激或癌基因过表达而发生，或由端粒缩短引起。端粒是染色体末端的特殊重复序列。它们在DNA复制过程中不被DNA聚合酶复制，而是由端粒酶合成。DNA聚合酶反应不能准确复制端粒的串联重复次数。因此，细胞间的端粒长度有很大差异。随着传代次数的增加，端粒会变得更短，除非它们被端粒酶修复。例如，在胚胎干细胞中，端粒酶活性很高，以维持端粒长度。与细胞株不同，胚胎干细胞不表现出衰老。 2.2.干细胞和分化细胞 从正常或癌变的分化组织中分离出的细胞通常根据化学和物理环境的不同程度保留它们的分化特性。许多从癌症组织中分离出的分化细胞，包括HepG2细胞（来自肝细胞癌）、Jurkat细胞（来自白血病的人类T淋巴细胞）和PC12（从大鼠肾上腺髓质的嗜铬细胞瘤中分离出的神经细胞，在培养中可以诱导形成树突，几十年来对生物医学研究非常有价值。它们都是连续的细胞系。尽管它们保留了一些它们衍生的组织的分化表型，但许多重要的组织特性都丢失了。过去三十年来，细胞表征和生长因子的研究工具的进步，使得从正常组织中培养各种分化细胞成为可能，包括内皮细胞、角质形成细胞、黑色素细胞、单核细胞和平滑肌细胞。这些原代组织细胞保留了许多组织特异性活性，不仅在研究中很有价值，而且可能对组织修复或再生有价值。然而，正如本章后面将讨论的，体内大多数分化细胞处于G0阶段的细胞培养中，并且不增殖。从这些组织中分离出的细胞具有非常有限的增殖潜力，并在培养中表现出表型不稳定性。对于可能的再生医学应用，从组织中分离出的分化细胞不是可持续的细胞来源。 干细胞必须能够自我更新（即，能够制造更多的自己）并分化为目标细胞。它们存在于许多成人组织中，并在它们的生态位中处于静止状态，只有在需要时才扩展和分化。一些成人干细胞已经被分离并在培养中生长了几十年，包括从骨髓中分离出的造血干细胞（HSC）和间充质干细胞（MSC）。它们的增殖潜力有限，在培养几代后，它们失去了更新和分化能力。这些成人干细胞是多能的，意味着它们可以分化成多种但数量有限的细胞系。即使增殖潜力不到无限，成人干细胞也有能力产生大量分化细胞（如来自MSC的骨细胞和肌肉细胞）用于异体应用。 与成人干细胞相比，在胚胎发育的非常早期阶段分离出的胚胎干细胞在体外具有几乎无限的自我更新能力，并且是多能的，意味着它们可以分化成所有成人组织类型的细胞。它们不会经历衰老，在再生应用中具有巨大的潜力。然而，由于它们来自受精的人类卵子，它们的使用在伦理上是有争议的。为了缓解这些伦理担忧，设计了一种过程，将成人体细胞重新编程为未分化的胚胎状态。这些诱导的多能干细胞（iPSC）可以通过引入四个外源基因（OCT4、SOX2、KLF4和c-Myc（OSKM））对成人组织细胞如成纤维细胞进行表观遗传重新编程来获得。iPSCs具有与胚胎干细胞相似的分化成不同细胞系的潜力。胚胎干细胞和iPSC都可以被引导分化成各种类型的细胞，包括造血干细胞、肝细胞（肝细胞）和胰岛细胞，方法是使用一系列生长因子的鸡尾酒来模拟体内分化条件。 2.3.生物制剂制造的细胞 通常用于生产生物制剂的细胞来自不同物种的不同组织。从不同物种中分离出的细胞在染色体数量和基因组序列上有所不同。然而，在生理和转录组水平上，来自不同物种相同组织的细胞非常相似。它们的相似性比来自同一物种的不同细胞类型要大得多。例如，鸡胚成纤维细胞在形态上非常类似于来自肺部或包皮的人类成纤维细胞，而上皮MDCK细胞看起来与狗成纤维细胞非常不同，尽管它们都来自同一物种。 尽管脊椎动物体内大约有两百种类型的细胞，用于生产生物制剂的大多数细胞要么是上皮细胞要么是成纤维细胞（表2.1，面板2.3）。这两种细胞类型通常容易从组织中分离并在体外培养，这一点在半个多世纪前的组织细胞分离的早期探索中已经得到证实。 NS0和CHO是用于治疗性重组蛋白生产的两个突出的宿主细胞系。它们表现出不同的行为，并且源自两种不同的组织和两种不同的物种。CHO细胞是从中国仓鼠的卵巢中分离出来的，而NS0细胞来自小鼠的骨髓瘤。用于重组蛋白生产的细胞主要是上皮细胞和淋巴细胞。成纤维细胞和上皮细胞也常用于病毒疫苗的生产。重组蛋白生产与疫苗生产对细胞系的选择基于根本不同的需求。前者要求易于遗传操作和分泌大量蛋白，而后者需要与病毒的嗜性相匹配的细胞以及最小的抗病毒反应。 上皮细胞排列在组织的“边界”，而成纤维细胞构成了更大的结缔组织部分。上皮细胞形成紧密连接的片层，这些片层经常受损、死亡并由“新”细胞补充。成纤维细胞大多处于静止状态。它们迁移到伤口中，并在受到各种信号刺激时才开始生长。骨髓瘤细胞衍生的终末分化的浆细胞分泌针对特定抗原的抗体。这些抗体只在宿主暴露于抗原后的有限时间内需要。这些细胞在分化为活跃的抗体分泌细胞后的两到三周内会经历凋亡，以便宿主不会继续在循环中拥有大量不需要的抗体分子。许多原始组织细胞的原生特征通常在组织来源的细胞系中仍然明显。 3.细胞膜 关于在生物反应器中培养哺乳动物细胞的一个过时但之前普遍持有的信念是，细胞极其脆弱，容易受到机械应力的影响，因为唯一阻止细胞内容物溶解到水环境中的是脂质双层膜。然而，在现代制造工厂中，细胞在数十立方米体积的生物反应器中，在高度湍流的条件下茁壮成长。包围细胞的质膜不仅仅是一个简单的脂质双层，细胞的完整性不仅仅由其膜包装决定。 3.1.脂质双层 构成脂质双层的脂质是两性磷脂。每个磷脂分子由一个甘油骨架连接一个包含带电磷酸基团的亲水头基和一个由两个脂肪酸组成的疏水尾基（图2.3）。疏水尾中的脂肪酸提供了在温和温度下形成有序膜结构所需的疏水相互作用。当悬浮在水溶液中时，两性分子可以形成胶束。在这样的胶束中，亲水头向外，疏水尾向内。胶束的组织使得它很容易在内部包裹疏水分子，而内外都没有水环境。相比之下，由脂质双层膜形成的球体则疏水尾向双层中间投影，亲水头在外部和内部表面。它可以很容易地在内外都有水环境（图2.4）。 图 2.3. 一个磷脂分子，其甘油与乙醇胺、饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸结合。 图 2.4. 凝胶态和液晶态的脂质双层膜。 脂质双层膜的行为类似于流体（面板2.4）。如果在特定位置用荧光染料标记脂质分子，由于分子扩散，荧光会迅速分散。双层膜中磷脂分子的侧向扩散系数约为10^-8 cm^2/s。气体物种在脂质双层中的扩散速度与在水中一样快。甚至大的蛋白质分子也在脂质双层膜中扩散。 尽管脂质双层膜是流体，但通过形成紧密堆积的有序结构，它成为了一个非常好的屏障，阻止大多数分子自由进出细胞。脂质分子在没有膜结合磷脂转位蛋白的帮助下不会翻转（即，改变其在脂质双层的侧面）。大多数生物大分子穿过脂质双层膜的通透性相当低。即使是最小的营养物质，如葡萄糖和简单的氨基酸，也不能频繁地通过以支持细胞生长。 所有主要的生物大分子（例如，DNA、蛋白质、多糖）是由共价键合的单体构成的生物聚合物。脂质双层膜不是聚合物，而是脂质单体的组装。细胞膜的非共价性质使其能够快速扩张、收缩、断裂、改变形状和融合。随着细胞的生长，细胞膜可以快速扩张，动态改变其组成和形状以满足细胞需求，而不会像聚合物生物分子那样分解许多共价键。 脂质双层膜不仅构成包裹细胞的细胞膜，它还包裹各种细胞器以分隔细胞内用于特殊功能的区域。细胞中的主要细胞器包括细胞核、线粒体、内质网（ER）、高尔基体和溶酶体。这些细胞器中的许多都处于不断的动态膜出芽和融合过程中。例如，在细胞器之间转运和蛋白质分泌过程中，“货物”在从一个细胞器转移到另一个细胞器时被包裹在膜囊泡内。 三种类型的脂质构成细胞和细胞器中的脂质双层膜：磷脂、糖脂和神经节苷脂（磷脂最常见）（面板2.5）。有几种不同类型的磷脂。最丰富的类型是甘油磷脂，它使用甘油作为骨架。其甘油的3-羟基团与磷酸基团相连，连接着乙醇胺或丝氨酸。甘油的其他两个羟基团通过酯键连接到两个脂肪酸。通常，这两个脂肪酸中的一个饱和，另一个不饱和，在C14和C24之间有一个顺式双键（面板2.6）。不饱和程度影响脂质双层的堆积。饱和脂肪酸允许更密集的堆积，而不饱和脂肪酸中的双键则产生弯曲，减少堆积并增加膜的流动性。 像其他脂质一样，脂质双层膜在相对温和的温度下经历从液态（或液晶态）到凝胶态的相变（图2.4）。脂质双层可能处于凝胶态或液晶态，这取决于温度和水合程度。脂质双层的相变温度受其脂肪酸和胆固醇组成的影响。 随着温度的降低，脂质双层从液晶态变为结晶态（或凝胶态）。较短的不饱和脂肪酸含量越高，脂质双层的流动性就越大，其相变温度就越低。 胆固醇是影响动物细胞膜性质的另一个关键分子（图2.5）。胆固醇有一个小的极性羟基头基连接到一个刚性的平面类固醇环区域，这些环区域又连接到一个更灵活的非极性尾部。胆固醇与磷脂相互作用，稳定靠近头基的区域，使脂质双层不易变为结晶态。总体而言，胆固醇增加了膜对小分子的通透性，并使膜流动性降低。不同脂质双层膜中的胆固醇含量各不相同。其在细胞质膜中的含量较高，但在细胞器膜中含量很低或不存在。 图 2.5. 胆固醇分子与脂双层膜一个单层中的两个磷脂分子相互作用的示意图。 3.2.膜蛋白 典型的生物膜大约含有50%的脂质和50%的蛋白质（按质量计）（表2.2，面板2.7）。在分子数量方面，脂质与蛋白质的比例约为50:1，因为蛋白质的分子量远高于脂质。膜的蛋白质含量受到来源组织和细胞器的极大影响。线粒体膜通过许多分子（例如，氨基酸、丙酮酸、各种离子和许多其他蛋白质）以高通量通过，其蛋白质含量约为75%。另一方面，作为神经细胞与其周围环境之间的保护鞘的髓鞘膜，其蛋白质含量约为25%。 脂质双层膜将细胞内容物与其周围环境分隔开，并将细胞器与细胞质分隔开。它们不仅作为物理保留细胞内容物的屏障，而且还可以创建膜两侧不同的化学环境。例如，细胞在质膜上维持约80毫伏的电势，在线粒体膜上维持约140毫伏的电势。内质网膜将氧化环境（内质网内）与还原环境（细胞质中）分隔开。 通过各种膜蛋白维持跨膜的各种化学、电和氧化还原势。大鼠小肠上皮细胞每细胞约有150,000个Na+泵，共同使每个细胞每分钟将约45亿个Na+离子运输出细胞。这些泵产生的钠和钾膜梯度，以及细胞质和线粒体膜上的电势，对细胞生物能量学至关重要。 3.3.膜动态 细胞膜处于动态状态；膜成分不断被添加和移除。这不仅是为了膜扩张和细胞生长，也是为了更新和囊泡运输。像其他细胞组分一样，细胞膜的更新是必要的，以替换被氧化或损坏的脂质分子，或允许细胞改变其膜组成以适应新环境。细胞膜蛋白也会被更新（面板2.8）。 细胞器间的运输和蛋白质分泌到细胞外环境也有助于膜的动态状态。注定要分泌或用于细胞表面的蛋白质分子通过居住在膜囊泡内，在细胞器（内质网和高尔基体）和细胞质膜之间运输。到达细胞质膜内表面时，这些囊泡与细胞质膜融合并释放其内容物到细胞外。 在肝脏中，每个肝细胞每分钟合成约120×10^3个白蛋白分子（相当于每天每细胞15皮克）。所有这些分子都被包裹在280-400纳米的膜囊泡中，并被运送到细胞的基底质膜。这些膜囊泡的注入将导致膜表面以每分钟0.5%的速率扩张（面板2.9）。然而，由于肝细胞通常处于G0状态（即，不分裂），它们的细胞质膜的大小不需要增加以适应细胞生长。即使它们正在增殖，由膜囊泡融合引起的膜扩张速率也远远高于细胞生长的需要。因此，添加到细胞质膜的脂质分子必须被回收回细胞内细胞器（高尔基体），以维持细胞质膜处于稳态。 同样，活跃的内吞作用的细胞可以内化高达每分钟0.8%的质膜。内吞作用引起的膜脂质损失必须得到补充，以维持细胞外膜的大小。因此，细胞膜，无论是细胞质膜还是与细胞器相关的膜，都是动态的，并处于稳态。 4.细胞质和细胞器 细胞质和细胞核都被细胞的细胞质膜包围。细胞质大致可分为两组：细胞器和高粘度的细胞溶胶。细胞溶胶含有非常高浓度的蛋白质（100-300毫克/毫升）。相比之下，血浆中的蛋白质含量仅为90毫克/毫升。细胞溶胶还含有无机溶质、构建块以及代谢反应的中间体和代谢物。 细胞溶胶不仅充满了可溶性组分（面板2.10）。它还包含大型颗粒（或聚集体）。核糖体是制造蛋白质的主要机械；它是一个由许多核糖蛋白和核糖核酸（rRNA）组成的复杂颗粒。每个细胞包含数千个约30纳米大小的核糖体。许多核糖体位于内质网的细胞溶胶表面，在电子显微镜下观察时呈现为黑点。一些酶也形成大型复合物，可以在电子显微镜下看到，如丙酮酸脱氢酶复合物。 细胞骨架的纤维状结构在细胞溶胶中也很丰富。这些大型蛋白质颗粒、酶复合物、细胞骨架蛋白和细胞器使细胞的细胞质非常拥挤，使其溶液相非常密集。在光学显微镜下，动物细胞似乎主要是被膜包裹的细胞质，中心附近有一个占据细胞直径一半以上的细胞核。除了细胞核，各种细胞器包括线粒体、内质网、高尔基体、过氧化物酶体、内体等，只能通过电子显微镜看到（图2.6）。 图 2.6. 哺乳动物细胞中的细胞器。 4.1.核 核是细胞中最大的细胞器，并且是除了线粒体外唯一具有双层膜的细胞器，它包含外核膜和内核膜，而不是仅有一个脂双层膜。核包含基因组，这些基因组被分隔成多个DNA分子，每个分子形成一个染色体。作为二倍体，哺乳动物的每个体细胞中都有两套染色体，一套来自母亲，一套来自父亲。DNA分子被分隔到核内的不同区域。一个对生物加工感兴趣的啮齿类动物的单倍体基因组大小约为2.8 Gbp（10^9个碱基对）。人类的约为3.3 Gbp。这相当于一个二倍体细胞中大约有6-7皮克的DNA。如果伸展开来，总的DNA（来自两套染色体）将超过2米长。通过形成DNA-蛋白质（组蛋白）复合物，大量的DNA被打包进核的小空间内。 核的外膜的细胞质侧与许多核糖体相关联。稍后将讨论，内质网是活跃翻译的场所。这些位于外膜上的核糖体在内质网膜表面的细胞质侧继续存在。 大量的物质通过核孔复合体在核质和细胞质之间进行交换，这些复合体穿过外膜和内膜（面板2.11）。DNA复制、各种RNA（信使RNA、转运RNA、核糖体RNA、非编码RNA、小核RNA等）的合成以及核糖体组装发生在核内区域。它们与细胞质中发生的代谢过程和蛋白质合成是分隔开的。在细胞质中合成的核苷酸和脱氧核苷酸被导入到核中用于RNA和DNA合成。包括信使RNA和转运RNA在内的许多RNA产物被导出到细胞质中，在那里进行翻译。核糖体由核糖体蛋白和rRNA在核仁中组装而成，随后被导出到细胞质中参与蛋白质合成。由于翻译发生在细胞质中，核糖体蛋白也是在细胞质中合成的，然后被导入到核中用于核糖体组装。在特定时刻决定哪些DNA片段或哪些基因将被转录成RNA的任务发生在核中。大量的转录因子和其他转录调节因子也在细胞质中合成，然后被导入到核中，它们在那里结合到特定的遗传位点上，以执行它们在转录中的作用。 因此，核与细胞质之间的物质交换量是巨大的。这种大量的交通，从小分子到蛋白质再到复杂的蛋白质-RNA核糖体组装，必须进行分类，以便不同的物种朝正确的方向移动。 4.2.线粒体 线粒体是细胞中数量最多的细胞器。每个细胞大约有1700个，占细胞体积的20%（面板2.12）。线粒体的大小与细菌相似，被认为起源于原始真核生物所获得的类似细菌的结构。 线粒体充当细胞的发电厂。细胞中最活跃的反应（例如，氧化营养物质并通过电子传递和氧化磷酸化产生能量）发生在线粒体中。具有不同能量需求的细胞具有不同数量的线粒体。在高能量需求的细胞中，可以多达3000个线粒体。 像核一样，线粒体也有双层膜（图2.7）。外膜维持它们的宏观形态，而内膜高度折叠，通常称为嵴，以产生更多的表面积。内膜是溶质运输的屏障。外膜富含由porin蛋白构成的孔，允许小于5000道尔顿的分子自由通过。由内膜和外膜包围的空间的化学环境与细胞质大致相同。内膜内的空间，称为基质，富含酶，是代谢中间体从葡萄糖代谢到CO2的最终分解发生的地方。当它们在某些生理条件下被用来产生能量时，脂肪酸和氨基酸的最终降解也发生在这里。 图 2.7. 质子和电位（电荷）梯度，以及物质流动，穿过线粒体内膜。主要物种的通量方向由箭头指示。注意，NADH氧化与电子传递耦合，会泵送质子逆着质子和电荷梯度，而驱动ATP合成的质子移动方向是顺着质子和电荷梯度。 通过TCA循环的丙酮酸氧化的化学势能储存在NADH中。在线粒体内膜上，NADH中处于高能状态的电子通过由多个蛋白质复合物组成的电子传递链（NADH脱氢酶、细胞色素C还原酶复合物和细胞色素C氧化酶复合物）传递，并泵出内膜中的H+。在电子传输结束时，电子与氧反应形成H2O。 ATP生成过程是通过位于内线粒体膜上的ATP合酶发生的。细胞中所有线粒体内膜的总表面积大于细胞质膜的表面积。因此，线粒体富含潜在的有害自由基。细胞将这些潜在的有害反应限制在线粒体内。 线粒体不仅在大小上类似于细菌，而且还拥有一个圆形DNA分子形式的基因组。每个哺乳动物线粒体包含一个或多个约15-17 kbp的线粒体基因组，编码一些线粒体蛋白和RNA分子。线粒体DNA复制的控制与基因组DNA复制的调节是分开的。线粒体拥有自己的核糖体和tRNA用于翻译，以及RNA聚合酶用于转录。然而，许多线粒体蛋白编码在细胞的基因组中，并在细胞质中合成后被导入到线粒体中。像其他细胞器一样，线粒体不能仅从其组分或来自核的遗传内容中生成；相反，细胞必须已经拥有一个线粒体，以便为其增殖生成更多的线粒体。线粒体的生物合成（即复制）是独立于细胞分裂的。 一个活跃的呼吸线粒体有一个大约-140毫伏的电位（内部为负）和内膜上几乎1个单位的pH差异。线粒体基质的pH值高于细胞质（即内部的H+浓度较低），因为H+是通过电子传递链逆浓度梯度泵送的。pH梯度和电位对于将NADH的化学势能转移到ATP至关重要。 当细胞的能量需求在很长一段时间内变得高时，它通过增加线粒体的数量来响应。在正常（非饥饿）培养条件下，碳能源（主要是丙酮酸）和氧进入线粒体的通量似乎在一个狭窄的范围内。虽然进入糖酵解的葡萄糖通量可以在很宽的范围内变化，但进入线粒体的丙酮酸通量受到更多限制。 4.3.溶酶体、过氧化物酶体、自噬体、内体 溶酶体是细胞内进行许多材料降解的小细胞器。其腔体内环境呈低pH值（约4.5），含有许多能够水解蛋白质、核酸和脂质的酶（面板2.13）。溶酶体膜上有质子泵以维持内部的低pH值。它是细胞摄入的材料和细胞不再需要的细胞材料降解的场所。大多数细胞材料都有有限的寿命，无论它们是催化化学反应还是起结构或机械作用。随着时间的推移，任何细胞材料都可能在结构的某部分被氧化或以其他方式进行化学修饰。这种“损伤”的积累可能会使蛋白质失去功能。因此，大多数蛋白质和其他细胞材料，如RNA和脂质，在有限的时间内被更新。许多这样的过程发生在溶酶体中。对于一些蛋白质，这发生在蛋白酶体中。蛋白酶体是由蛋白水解酶组成的复合物，能够降解蛋白质。需要更新的蛋白质被泛素标记并送往蛋白酶体降解。溶酶体不是垃圾箱，而更像是回收中心。它们在脂质稳态中起着重要作用。从细胞外环境和其他细胞器中摄取的脂质被处理后重新分配，以维持不同细胞器膜中适当的脂质组成。 像溶酶体和蛋白酶体一样，自噬体参与细胞的“大扫除”。然而，它们具有双层膜，可以将受损的材料包裹起来。它们可能很大，因为它们可能需要吞噬受损的细胞器、摄入的微生物或受损的蛋白质（这个过程称为自噬）。然后它们将内容物运送到溶酶体。 通过内体，真核细胞可以通过将颗粒包裹在细胞膜内并将其作为被脂双层包裹的囊泡摄取进来，从而摄取外部颗粒（面板2.14）。本章稍后将讨论的内吞途径也参与了涉及蛋白质分泌的细胞材料的回收。在更高生物中，一些细胞是专门的“清道夫”，它们吞噬外来颗粒或死亡的细胞。 在脂肪细胞中，脂质的分解发生在过氧化物酶体中（面板2.15）。这些代谢过程中的反应产生大量的活性氧，因此需要被包含在这些专门的细胞器内。 4.4.内质网 内质网从核膜延伸出来，是蛋白质折叠以供分泌或输送到许多细胞器和表面的细胞器（面板2.16）。它也是脂质合成的主要场所。根据其在透射电子显微镜下的形态，大致分为光滑内质网和粗糙内质网。光滑内质网富含参与化学转化反应的酶。在肝细胞中，光滑内质网扮演解毒的角色；在卵巢和睾丸中，它产生激素。粗糙内质网的细胞质表面有核糖体结合，因此在电子显微镜下看起来粗糙。它是为某些细胞器、质膜和分泌而预定的蛋白质的合成、折叠和加工的场所。据估计，大约有30%的所有细胞蛋白质是在粗糙内质网中合成的。体内专业的分泌细胞，如分泌胰岛素的胰岛β细胞和分泌抗体的浆细胞，拥有丰富的内质网。当B细胞（非抗体分泌）分化成浆细胞时，内质网和高尔基体急剧扩张，超过15倍（面板2.17）。 肝细胞分泌许多蛋白质，包括白蛋白和血液中的许多蛋白质成分。在肝脏中，一些肝细胞专门从事蛋白质分泌，而其他细胞在氧化解毒中扮演主要角色。这些肝细胞具有独特的内质网。那些参与蛋白质分泌的肝细胞拥有丰富的粗糙内质网，而那些专门从事异生物质代谢的肝细胞则拥有丰富的光滑内质网。 内质网也是蛋白质翻译后修饰的主要场所（面板2.18）。内质网腔富含促进蛋白质折叠的蛋白质。二硫键在内质网中形成，天冬酰胺残基（N-糖基化）上的糖基化初始步骤也在那里发生。内质网参与Ca2+稳态，其高Ca2+作为维持细胞质Ca2+浓度低的储备，除非需要。内质网也是脂蛋白和胆固醇合成的场所。 4.5.高尔基体和蛋白质翻译后修饰 高尔基体在细胞质的不同位置呈现为几十堆三到七个扁平囊的形态（面板2.19）。它们通常靠近内质网，堆叠连接成丝带状结构。高尔基体大致分为四个隔间：顺式、中间、反式和反式高尔基网（TGN）（图2.8）。分泌和膜蛋白在内质网中折叠后被转移到高尔基体，首先到顺式高尔基体，然后通过膜囊泡到中间和反式隔间。然后，在TGN中，蛋白质被分类并运输到不同的细胞器或质膜以分泌。当蛋白质通过不同的高尔基隔间时，它通过糖基化、硫酸化等化学修饰（面板2.20）。这些化学修饰所需的酶在四个高尔基隔间中的分布并不均匀。因此，不同的反应在不同的隔间中发生。估计有100-200个糖基转移酶，各种核苷糖的转运蛋白，是构成高尔基酶大部分的膜蛋白。 图 2.8. 蛋白质的合成和分泌到细胞外环境。详见第2.21节和文本以获取详细信息。 5.通过内质网和高尔基体的蛋白质分泌 据估计，在真核基因组编码的所有蛋白质中，有20-30%是膜蛋白，这些蛋白质通过内质网和高尔基体进行处理。对于一个工业重组蛋白生产细胞系来说，分泌的重组产品构成了通过内质网和高尔基的蛋白质的很大一部分。这些细胞将很大一部分蛋白质处理能力投入到分泌蛋白产品中。 尽管有些蛋白质在细胞质中完全合成后被转位到内质网，但大多数（包括典型的重组蛋白产品）是作为新生蛋白分子被转位的（图2.8，面板2.21）。注定要分泌、质膜和细胞器的蛋白质在氨基末端有一个五到三十个氨基酸的前导序列。这些信号序列作为每个蛋白质目的地的标志。成熟的mRNA带有聚腺苷酸尾（polyA尾）从细胞核导出到细胞质后，一个核糖体绑定到mRNA的翻译起始位点并开始翻译。 新生蛋白质的信号肽被合成，然后被内质网附近的信号识别颗粒（SRP）识别。SRP与信号序列的结合导致翻译暂停，并将新生蛋白质（仅具有整个序列的初始片段）以及核糖体和mRNA停靠到内质网膜上的一个转位器（也称为translocon或转位通道）。然后新生多肽通过转位器转入内质网腔，但核糖体和mRNA留在内质网的细胞质表面。随后，翻译延伸恢复，延伸的多肽通过转位器的通道进入内质网腔。随着翻译沿着mRNA的下游进行，新的核糖体继续绑定到mRNA的翻译起始位点，启动信号肽的合成，并重复将新生蛋白质转入内质网的过程。因此，在内质网的细胞质侧，每个mRNA分子都有多个核糖体积极翻译靠近转位器的蛋白质。 多肽的折叠在转入内质网腔后立即开始。在内质网腔中延伸的多肽上的信号肽在进入内质网时被切除。一类内质网分子伴侣和其他促进蛋白质折叠的蛋白质作用于新生蛋白质分子，防止它们聚集并促进折叠。它们的作用需要细胞能量（ATP）。内质网腔分子伴侣的一个重要成员，BiP（也称为GRP78），也是转位器复合物的一个组成部分。BiP结合在未完全折叠蛋白质的疏水氨基酸上，防止它们聚集。除了BiP，主要的内质网腔分子伴侣包括蛋白二硫键异构酶（PDI），它促进正确的二硫键形成。 在蛋白质分泌过程中，N-糖基化发生在蛋白质上，从内质网开始并持续到高尔基（图2.8）。它被称为N-糖基化，因为寡糖与特定序列上蛋白质的天冬酰胺残基相连。当蛋白质正在合成和折叠时，一个预装的含有三个末端葡萄糖残基的寡糖被转移并共价连接到天冬酰胺上（图2.9）。将糖基添加到蛋白质上增加了其以可溶形式的稳定性。它也是蛋白质折叠的一个重要标志。当蛋白质经历折叠时，葡萄糖残基被切除。一个葡萄糖基转移酶向任何未正确折叠的蛋白质上的非糖基化糖上添加一个葡萄糖，留下完全折叠的蛋白质有一个没有末端葡萄糖的N-糖基。Calnexin和calreticulin是凝集素（糖基结合蛋白）。它们结合在只有一个葡萄糖残基的蛋白质上的糖基上，并将其保留在内质网中以进一步折叠。一旦蛋白质完全折叠并且没有末端葡萄糖，它就准备好转移到高尔基体了。然后未正确折叠的蛋白质分子被导出到细胞质并在蛋白酶体中降解。 图 2.9. 从N-糖基化物上修剪葡萄糖作为正确蛋白质折叠的信号。 完成折叠过程的蛋白质分子定位在内质网的一些区域，那里的内质网膜被COPII蛋白覆盖。含有折叠蛋白质并被COPII覆盖的膜囊泡随后从内质网出芽并被导出到顺式高尔基。在高尔基中，进一步的翻译后修饰发生。顺式、中间、反式高尔基和TGN由一系列连接的微管组成，不同的酶在蛋白质上进行不同的修饰。通常包含三到七个囊泡堆叠的中间高尔基是糖蛋白糖链延伸的主要场所。从隔间出芽和与另一个隔间的分裂是蛋白质从内质网到高尔基以及高尔基隔间之间运输的主要形式。高尔基隔间的表面装饰有形成卷曲螺旋的蛋白质（golgin），它们几乎像触手一样帮助捕获囊泡。 除了分泌，蛋白质还针对不同的细胞器和不同区域的质膜。在TGN中，蛋白质根据目的地被分类到膜囊泡中。囊泡被不同蛋白覆盖以标记它们的目的地。膜囊泡的运输由微管协助。稍后将讨论，微管可以快速聚合和解聚，形成轨道状，因此可以用来引导囊泡货物到达正确的位置。 随着物质的运输，早期隔间的膜和内容物被转移到ER的后期隔间、高尔基体、不同的细胞器和质膜。这样的物质流动需要通过相反方向的类似物质流动来平衡。因此，蛋白质分泌过程不仅涉及将膜囊泡前向转移到后期隔间和质膜，还涉及通过内吞作用和逆行运输将膜和其他成分返回到它们原始的隔间，以维持每个隔间处于稳态。因此，内质网、高尔基体、溶酶体和内体都是分泌网络的一部分。它们通过膜囊泡的动态运输进行通信。翻译完成后，蛋白质分子需要有限的时间进行折叠、糖基化，然后被排泄。一个平均长度约为350个氨基酸的蛋白质的完整翻译仅需约一分钟。相比之下，根据蛋白质的性质，合成的蛋白质分子的分泌需要从数十分钟到几个小时不等。α1-抗蛋白酶是分泌最快的蛋白质之一，半衰期约为28分钟（表2.3）。转铁蛋白和IgG的分泌大约需要两个小时。一般来说，分泌的蛋白质分子在内质网中花费的时间比在高尔基体中多。 我们可以将蛋白质货物通过不同隔间向TGN行进的过程视为通过一系列生物反应器的生产流。关于蛋白质分子如何通过，有两种理想化的情况，一种类似于连续流动反应器（PFR），另一种类似于连续搅拌槽反应器（CSTR）。这两种反应器类型将在第8章讨论。在PFR模型中，所有分子像游行中的乐队一样一起移动，同时进入反应器的分子一起离开。在CSTR模型中，分子进入反应器然后在内部循环，每个分子被随机取出的机会相等，不管它在反应器中待了多久。如果高尔基体中的蛋白质分泌过程表现得像PRF，所有分子将受到相同程度的酶修饰；如果它表现得像CSTR或一系列CSTR，一些分子将在反应器中花费更多时间，可能比其他分子更广泛地被酶修饰。蛋白质分泌的性质可能既不是PFR也不是CSTR。然而，分泌蛋白质的停留时间可能分布在一个范围内。 实验观察确实表明，同一蛋白质的不同分子的分泌时间不是均匀的，而是分布在一个范围内（面板2.22）。这通过使用药物阻止蛋白质分泌然后移除该药物来说明；在蛋白质分泌恢复后，荧光标记的蛋白质分子以不同的速率通过不同的细胞隔间。高尔基中的糖基化反应，从一个核心寡糖到完全延伸的产物，涉及分布在不同隔间的十多种酶。由于不同的分子在每个隔间中花费不同的时间，它们受到不同程度的不同反应的影响。在高尔基中的停留时间分布有助于糖基化的异质性。 6.跨细胞膜的运输 将细胞与其环境分隔开的脂双层膜，以及将细胞器与细胞质分隔开的膜，对物质交换构成了障碍。它对大型和小型分子的渗透性都非常低（图2.10）。在细胞的营养物质和代谢物中，只有氧气、脂肪酸、乙醇和一些脂质能够足够快地通过膜以满足细胞生长的需要。需要专门的运输机制来介导绝大多数营养物质的运动和代谢物的排泄。 图 2.10. 一些溶质通过脂质膜的渗透性的数量级。 细胞拥有大量运输蛋白（有时称为渗透酶），允许小分子（约1千道尔顿，例如糖、寡糖、氨基酸、小肽、核苷酸、胆固醇、离子、有机酸等）穿过细胞质膜和各种细胞器的膜。大分子通过膜囊泡（如通过内质网和高尔基体的分泌过程）、胞饮作用或外泌作用穿过膜。特定的受体参与吸收大型蛋白质和复合物，如低密度脂蛋白（LDL）和转铁蛋白。 6.1.溶质运输蛋白的类型 主动和被动运输 细胞溶质跨膜运输可以分为两种类型：被动运输，它沿着其浓度梯度运输溶质，从膜的高浓度侧运输到低浓度侧；主动运输，它从低浓度侧运输溶质到高浓度侧（图2.11，面板2.23）。前者在热力学上是有利的，而后者必须与放热过程耦合才能使运输成为可能。提供主动运输所需的化学势能的耦合过程之一是ATP的水解。另一个是跨膜的大浓度梯度的第二种溶质的共转运。第二种溶质的共转运的化学势能变化提供了足够的净能量变化，以驱动第一种溶质逆其浓度梯度运输。例如，肠道钠依赖的葡萄糖转运蛋白依赖于外部超过10倍的钠浓度来驱动葡萄糖从肠道腔内的低水平区域运输到内部细胞中具有更高葡萄糖水平的区域。因此，钠转移的驱动力“推动”葡萄糖逆其浓度梯度移动。 图 2.11. 主动运输和被动运输。主动运输需要由ATP水解或共转运溶质如H+或Na+提供的化学势能。 转运蛋白和通道蛋白 从结构角度来看，溶质沿浓度梯度的运输可以通过载体蛋白（转运蛋白）或通道蛋白进行（图2.12，面板2.24）。 图 2.12. 通道蛋白和转运蛋白。 通道蛋白在膜中形成一个管道状结构，特定于某些溶质，如水、Na+或K+。通道蛋白存在于开启或关闭状态。一旦通道打开，溶质的转移在降低浓度梯度的方向上非常快。通量非常快，受膜上通道蛋白分子数量和通道开启时间的影响。 载体介导的转运介导的是促进扩散。首先，来自膜高浓度侧的溶质扩散进入转运蛋白并停靠在转运蛋白的结合域。接下来，溶质被转移到膜的低浓度侧。一旦到达低浓度侧，溶质被暴露并可以自由扩散。在正常培养条件下，葡萄糖和一些氨基酸通过促进扩散进行运输。 促进扩散的转运蛋白介导可逆运输。转运蛋白的运输速率取决于膜两侧溶质的浓度差。通常，转运蛋白对捐赠侧的溶质有很高的亲和力，这有助于促进溶质的结合，而在下游侧有较低的亲和力以促进溶质的释放。如果一侧的溶质浓度远大于另一侧，则速率通常仅取决于捐赠侧的溶质水平。这种运输机制类似于典型的酶催化将底物转化为产物。运输速率对溶质浓度的依赖可以用米氏-门顿动力学方程来描述。在低浓度下，运输速率与溶质浓度成正比。在高浓度下，随着转运蛋白饱和，速率保持恒定。米氏常数（KM）用于将运输速率表示为溶质浓度的函数。KM是运输速率为最大值一半时的溶质浓度。 葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）是一种无处不在的葡萄糖转运蛋白。GLUT1的米氏常数（KM）约为0.1-1 mM。在0.1-1 mM范围内，细胞的葡萄糖进口速率随着葡萄糖浓度的增加而增加。在细胞培养基中常用的浓度范围（1-10 g/L，或5.5 mM至55 mM）内，葡萄糖运输速率接近最大值，不受葡萄糖浓度的影响。 单向转运体和共转运体 促进扩散和主动运输的转运蛋白也可以根据每个转运蛋白携带的溶质数量和溶质流动方向进行分类（图2.13，面板2.25）。 图 2.13. 单向转运体以及两种共转运体：同向转运蛋白和反向转运蛋白。 单向转运体从高浓度侧向低浓度侧转移单个溶质，例如葡萄糖的GLUT1转运蛋白和果糖的GLUT5转运蛋白。共转运体和反向转运体同时转移两个溶质。将两个溶质朝相同方向传递的转运蛋白称为共转运体。相反，反向转运体将两个溶质朝相反方向转移。共转运体和反向转运体统称为共转运体。共转运体通常用于运输带电的有机分子。可解离的溶质与对离子一起移动以维持电荷中性。当带电溶质从膜的一侧移动到另一侧时，必须维持电荷中性。否则，净电荷将在膜上积累并产生电位，这将减缓溶质的进一步转移。例如，乳酸在中性pH的水溶液中以乳酸盐的形式存在。如果乳酸盐从膜的一侧移动到另一侧而没有伴随正电荷的物种，如H+，细胞膜将在乳酸盐接收侧变为负电荷，在乳酸盐捐赠侧变为正电荷，最终在膜上产生电压，阻止带负电的乳酸盐的进一步运输。因此，许多解离的有机酸通过共转运体运输，以防止膜上产生电荷。 通常采用两种机制来维持膜上的电荷中性：a）通过共转运体与对离子（如乳酸盐的H+）共转运，b）与相同正电荷或负电荷的离子共转运，但方向相反（如HCO3-的Cl-）。 在共转运体介导的转移中，运输速率不仅受膜两侧溶质的浓度差的影响，还受共转运离子的浓度梯度的影响。例如，单羧酸盐转运蛋白（MCT）运输乳酸的速率不仅受乳酸浓度的影响，还受细胞质和培养基之间的pH差异的影响。 类似“泵”的转运蛋白 我们使用泵来运输水。有时，泵被用来克服重力并将水提升到更高的位置，而其他时候水本来就在向下流动，但泵被用来更快地移动它。在溶质跨膜运输中，有时使用能量来克服浓度梯度（主动运输），如在泵水上山的情况；在其他情况下，能量被用来加速运输（图2.14）。 图 2.14. “泵”式转运蛋白。 肠道上皮的Na+/葡萄糖转运蛋白（SGLT）即使在葡萄糖水平低于细胞时也可以从消化道中吸收葡萄糖。这是通过使用Na+/葡萄糖转运蛋白从肠道腔室中运输两个Na+进入细胞实现的，其中Na+水平非常低（图2.14）。随着钠离子的运输，葡萄糖分子也结合到转运蛋白上并同时被运输。Na+穿过膜的倾向如此之高，以至于它可以驱动葡萄糖逆着大的浓度梯度移动。Na+穿过膜的驱动力不仅来自Na+的浓度差异，还来自负膜电位的吸引力，膜电位为-80 mV。 主动运输的另一种类似泵的转运蛋白是ATP结合盒（ABC）转运蛋白，它利用ATP作为能量源运输某些疏水化合物（图2.14）。它的突变涉及许多人类疾病。它还涉及通过将药物泵出细胞，导致药物在细胞内浓度低，从而对许多药物产生耐药性。即使其外排沿其浓度梯度，运输速率也会很低。有了ATP驱动的转运蛋白，速率就提高了。在长期暴露于氨甲喋呤后，一些癌细胞可以通过使用ABC转运蛋白将药物泵出细胞，从而产生耐药性。第三种类似泵的转运蛋白，Na-K ATP酶，将在下文描述。 离子运输和膜电位 细胞内液含有多种无机离子。一些微量元素（Fe^3+、Zn^2+、Co^3+、Se^2+）的浓度非常低。许多离子种类（Na^+、K^+、PO4^3-、Mg^2+、HCO3^-、Cl^-）的浓度在毫摩尔范围内（面板2.26）。所有这些都依赖于转运蛋白穿过细胞膜。其中一些还通过通道蛋白以受控的方式运输，以控制膜电位并维持细胞内的稳态水平。这些离子在细胞质中的浓度差异很大。它们在细胞膜上也面临不同的浓度差异。例如，Na^+和K^+在质膜上的浓度梯度方向相反。细胞内K^+的浓度比细胞外高20-50倍，而Na^+的浓度则比细胞内高10-15倍。 除了主要离子的浓度梯度外，细胞还维持其质膜上-80 mV的电位梯度（细胞内为负）。这个电位对许多化合物跨膜运输至关重要。由于脂双层膜的电容很大，只需要转移极少量的正电荷离子（例如K^+、Na^+）从细胞质到细胞外空间就能产生80 mV的电荷差异。产生膜电位所需的离子转移数量比细胞内总离子数低几个数量级，它们的转移不会引起它们细胞内浓度的任何变化。 钠-钾ATP酶在维持细胞内Na^+和K^+水平中发挥关键作用（图2.14）。它使用ATP作为能量源，将2个K^+转移到细胞质内，将3个Na^+从细胞质外排。它存在于所有哺乳动物细胞的细胞膜中。细胞质膜对离子并非绝对不通透。它允许Na^+和K^+以非常慢的速率跨膜扩散。由于它们在膜通透性上的微小差异，K^+比Na^+扩散得更快。细胞内的K^+也通过钾通道泄漏出来。Na^+/K^+ ATP酶和通道及膜的泄漏的联合作用有助于平衡Na^+和K^+梯度和膜电位。细胞还有氯离子泵将带负电的Cl^-泵出细胞。在一些细胞中，Na^+和Cl^-通道蛋白也有助于维持膜电位在正确的范围内。跨膜的电位在溶质运输中起着重要作用，如Na^+/葡萄糖转运蛋白所示。 7.细胞形状、力学和运动 细胞呈现出许多不同的形状。在血液中循环的大多数是球形的。许多上皮细胞是立方体，而在培养皿上培养的成纤维细胞像煎蛋一样展开，还有长长的纺锤。培养的细胞形状可以告诉我们很多关于细胞类型、其分化状态和其健康状态的信息。在现代生化和分子生物学分析工具可用之前，观察细胞形状是，现在仍然是，判断细胞“状态”的主要工具。细胞的形状是细胞内部结构组织之间的力量平衡以及细胞与相邻细胞和它所附着的表面之间相互作用的结果。因此，细胞形状是细胞力学特性的反映。 细胞形状是动态的。细胞出于各种原因从一个地方移动到另一个地方。在胚胎发育中，它们可能移动到新的位置分化成新的组织。在成年人中，它们可能移动以修复受损的组织。两个子细胞在细胞分裂后彼此远离。当细胞移动或分裂时，其力学特性、形状以及与其他细胞和表面的相互作用也会发生变化。简而言之，细胞的内部力学结构、与相邻细胞的相互作用以及与它所附着的表面的相互作用共同影响其形状、运动以及细胞内和细胞外的力学作用。 细胞的内部力学结构由细胞骨架蛋白控制。细胞-细胞相互作用受接合蛋白和许多细胞-细胞粘附分子的影响。细胞分泌细胞外基质，这些基质覆盖在表面上，具有促进自身或其他细胞分化的特性。这些细胞外基质在发育过程中也会经历动态修改。 这些细胞培养方面以前对过程工程师的兴趣较小，当焦点仅集中在悬浮生长的高度适应的重组细胞上时。随着对再生医学和细胞治疗应用中细胞的兴趣日益增加，维持细胞的分化状态至关重要，更好地理解细胞-细胞和细胞-表面相互作用变得重要。 7.1.细胞骨架 细胞的细胞骨架由三个主要组成部分构成：肌动蛋白丝、微管和中间丝。这些赋予细胞形状并在其内部传递力量（图2.15）。肌动蛋白丝和微管分别是它们的单体肌动蛋白和微管蛋白的球状蛋白的组装。单体的组装需要以ATP（肌动蛋白）或GTP（微管蛋白）形式的化学势能。单体堆叠成组装体时，单体之间不形成共价键。中间丝也是聚合物，但由单体丝蛋白制成。 图 2.15. (a) 肌动蛋白丝，(b) 微管，(c) 中间丝。 肌动蛋白丝、微管和中间丝都是多股的螺旋型纤维，可以延伸到相当的长度。直径约8纳米的肌动蛋白丝是三者中最小的。微管是空心的，直径约为25纳米。中间丝直径约为10纳米。 肌动蛋白丝和微管可以通过组装或解聚单体迅速增长或缩短长度。由于单体以头对尾的方式形成组装体，它们的纤维是极化的。纤维和单体与许多辅助蛋白相互作用，这些辅助蛋白将纤维调节为动态或静态状态，并决定纤维形成的网络类型。单体蛋白还含有核酸（肌动蛋白中的ATP，微管蛋白中的GTP），在组装过程中转化为ADP或GDP。 肌动蛋白丝 肌动蛋白丝由两股或三股细丝组成，像绳子一样扭曲形成单股丝（图2.15，面板2.27）。 这种几何形状增强了它们的结构完整性，同时保持了高度的灵活性。大量的辅助蛋白控制肌动蛋白单体的成核，并指导它们组装成不同类型的网络，这些网络具有不同长度的肌动蛋白丝、交叉链接、捆绑和固定到细胞膜。这些辅助蛋白帮助调节细胞内不同类型肌动蛋白网络的空间分布。在细胞的质膜下方通常可以看到大量的肌动蛋白，形成一个凝胶状结构，称为皮层。在免疫荧光显微镜下，用抗肌动蛋白抗体对细胞进行染色后，肌动蛋白呈现网状束状。皮层作为外部机械扰动的首个吸收器，赋予脂双层其局部形状。许多细胞类型，如成纤维细胞，在组织和培养中都延伸其身体并在表面上铺展平坦。附着细胞的边缘有一个不规则的形状，很像在平底锅上放置的鸡蛋。在突出的区域，肌动蛋白纤维定位在膜伪足和丝状伪足中。在突出的丝状伪足中，肌动蛋白丝形成密集标记的平行纤维束。而在膜伪足中，它们形成交叉链接的非平行网络。这两种类型的网络可以重组，丝状伪足区域在细胞运动期间从膜伪足中突出。在静止的细胞中，肌动蛋白纤维形成长应力纤维，可能跨越整个细胞长度的大部分。应力纤维连接到焦点粘附（细胞质膜与基质表面接触的位置）并建立细胞与细胞外基质之间的张力。应力纤维也通过粘附连接到相邻的细胞。 微管 微管是由13根α-和β-微管蛋白（称为原丝）组装而成的中空管（图2.15和图2.16，面板2.28）。像肌动蛋白丝一样，单体的头对尾组装使微管具有方向性，产生一个“+”和一个“−”端。微管的两端可以通过组装或解聚反应快速延伸或收缩。许多微管的负端汇聚在一个称为微管组织中心（MTOC）的区域。最大的MTOC是中心体，从中延伸出大量的微管“+”端向外。许多辅助蛋白与微管和微管蛋白结合并相互作用。一些微管相关蛋白（MAPs）稳定微管或促进微管与细胞组分的相互作用，如结合到细胞膜。其他辅助蛋白促进解聚、成核、捆绑或交叉链接。因此，微管是影响细胞形状的主要结构组分，无论是静态还是动态。 图 2.16. 培养上皮细胞层中培养的成纤维细胞的细胞骨架。肌动蛋白丝显示为交叉的井号标记，中间丝为流动的灰色线条，微管显示为虚线复合线条。 微管也是细胞运动功能的主要参与者。它们通过作为马达蛋白（如驱动蛋白和动力蛋白）可以沿其滑动的轨道，消耗ATP来实现这一点。马达蛋白通过与其他结合各种货物的蛋白质形成复合物，例如分泌膜囊泡或细胞器，然后可以沿着微管运输货物。 中间丝 与所有真核细胞普遍存在的肌动蛋白丝和微管不同，中间丝只出现在一些动物中，包括脊椎动物、线虫和软体动物（图2.15和图2.16，面板2.29）。尽管所有中间丝共享常见的结构特征，它们由许多不同的分子组成，其表达是组织特异性的。例如，核纤层蛋白存在于细胞核中，波形蛋白在许多间充质细胞中，角蛋白在上皮细胞中。中间丝的主要作用是传递机械力和提供细胞的机械特性。例如，中间丝角蛋白赋予皮肤外层其韧性。虽然多样的中间丝在氨基酸序列上并不保守，但它们在主要蛋白域上是保守的，并在分子组织上共享共同特征。中间丝的一个共同特征是它们形成头对尾的卷曲异源二聚体，然后一对二聚体形成一个反平行和对称的四聚体。因此，中间丝与肌动蛋白丝和微管根本不同，后两者是具有“+”和“−”端的极性。四聚体亚基堆叠在一起形成纤维。每个中间丝纤维由多个微丝组成，这些微丝又由一系列亚单位蛋白组成。 这些中间丝纤维是灵活的。与可以具有数十微米持久长度的微管和肌动蛋白丝不同，中间丝可以在短距离内弯曲，并能够吸收外部力量施加的能量并将其传递到细胞的其他区域。在组织中或在培养中相互连接的细胞中，中间丝也有助于在细胞之间传递力量。 7.2.细胞外基质和整合素 身体中的绝大多数细胞都嵌入在由蛋白质和多糖组成的非细胞组织结构中（图2.16，面板2.30）。在组织分化过程中，这些结构可能钙化为骨骼、软骨、上皮层下的结缔组织或其他特殊组织，或者形成细胞所坐的基底膜（也称为基底板层）。各种细胞分泌的多种糖蛋白（与寡糖连接的蛋白质）和蛋白聚糖（核心蛋白与一个或多个糖胺聚糖（GAG））提供了细胞外基质（ECM）的核心成分（面板2.31）。例如，成骨细胞分泌胶原蛋白、其他骨骼形成蛋白和羟基磷灰石；软骨细胞分泌胶原蛋白、透明质酸和蛋白聚糖；成纤维细胞分泌胶原蛋白和纤维连接蛋白。 组织细胞不仅分泌不同的ECM组分，还将其组织成不同的结构，赋予不同组织的特殊特性。例如，胶原纤维可能朝一个方向排列，而不是随机盘绕。ECM的化学成分以及作为细胞局部环境的物理组织影响细胞分化和维持分化特性。当在塑料或玻璃表面上体外培养时，细胞在附着后将这些物质分泌到表面上，形成它们所居住的ECM。对于胚胎干细胞的体外培养，使用层粘连蛋白涂层培养皿以维持它们的多能性；而在培养从肝脏分离的原代肝细胞时，使用I型胶原蛋白。许多ECM组分具有高度的负电荷。这允许许多蛋白质生长因子被吸附到ECM上并释放到周围细胞，甚至可能作为趋化因子。因此，它们也在提供细胞迁移和分化的线索方面发挥作用。 整合素和细胞-ECM相互作用 ECM的生物学作用不仅仅是为细胞粘附提供适当的表面，而且还提供与特殊细胞特性表达和生长控制相关的细胞表面相互作用（面板2.32，图2.17）。当在同一类型的ECM上培养时，相同类型的细胞可能表现出非常不同的形状和其他细胞行为。对不同ECM的不同反应是通过称为整合素的跨膜细胞表面受体介导的，它们将细胞外ECM连接到细胞内细胞骨架，并传递细胞外微环境的化学和物理特征到细胞内信号事件。整合素是由不同的α和β链组成的异二聚体。不同的α和β链组合赋予了对不同ECM分子的特异性结合。例如，α5β1整合素与纤维连接蛋白结合，而α6β1整合素与层粘连蛋白结合。在细胞内方面，整合素主要在一些辅助结合蛋白的帮助下与肌动蛋白丝结合。不同的细胞类型表达不同的α和β链，因此形成具有不同结合亲和力的不同整合素复合物，以结合各种ECM组分。因此，不同细胞类型通常对粘附、生长或维持其分化特性有不同的ECM要求。为了建立ECM和细胞骨架之间强大而稳定的相互作用，多个细胞-基质连接复合物聚集在一起形成焦点粘附。 整合素异二聚体可以存在于积极状态，与ECM、肌动蛋白丝和其他相关蛋白结合，或处于非活动状态。这种状态的转换允许细胞施加或解除内部和外部机械相互作用。状态的转换是通过与细胞的信号蛋白耦合来促进的。细胞-基质连接与信号激酶或其他信号系统蛋白相关联。信号传递发生在细胞膜的两侧，从细胞内到细胞外环境，反之亦然。整合素与ECM蛋白的结合可以激活整合素，允许肌动蛋白丝结合。相反，整合素的内部信号激活也可以启动通过整合素的肌动蛋白丝和ECM的连接。 图 2.17. 整合素及细胞外基质与细胞骨架之间的相互作用。 通过细胞-ECM连接的肌动蛋白丝的内拉导致张力力，该力通过细胞骨架纤维传递。在锚定依赖性细胞的情况下，张力力提供了允许细胞周期继续进行的必要信号。 7.3.细胞运动 绝大多数细胞能够在表面上移动。通常，细胞运动可能是由于对可扩散化学物质或表面上有利的ECM的吸引，或随机运动。细胞运动涉及细胞骨架的重组，膜的突出，细胞一侧表面粘附的建立，最后是细胞膜从细胞后端的粘附复合物中脱离。移动细胞的肌动蛋白丝和质膜使细胞延伸成更细长的形状，并形成可能含有称为微刺的伪足的层状伪足（图2.18，面板2.33）。肌动蛋白丝的重组发生在移动细胞前缘的几分钟内。在“开放”表面（即不拥挤）上，细胞随机移动。它们表现出运动和接触回避，这意味着当两个移动的细胞相遇时，两者都会朝相反方向移动。此外，当细胞分裂完成时，分裂的母细胞的两个子细胞会彼此远离。细胞迁移受许多因素调节，包括生长因子。例如，上皮细胞对肝细胞生长因子的反应是相互远离并变得更加分散，而不是形成上皮细胞典型的细胞簇。 图 2.18. 正在移动的成纤维细胞。从前沿伸出的伪足和少量的丝状突起。 在细胞生物加工中，并没有意图控制或操纵细胞迁移。在将粘附细胞培养在表面上的情况下，它们可能在细胞接种后重新分布。然而，由于它们的运动主要是随机的，它们通过接触回避分布自己的能力限制在数十个细胞长度的局部区域。在细胞接种过程中，均匀分布它们仍然很重要。 8.生长控制 动物从胚胎到成年的生长是通过不同组织中细胞水平上对细胞质量和细胞数量增加的控制来调节的。细胞质量和细胞数量的增加可能并不总是同步的，但在几个细胞世代的过程中它们是同时发生的。尽管我们只看到了发展的增长方面，但在细胞水平上，一个生物体的生长和维持不仅涉及细胞生长，还涉及细胞死亡。细胞的生长和死亡都是严格调节的，或者是有计划的。研究得最透彻的计划性细胞死亡是凋亡。细胞生长控制和凋亡将是以下讨论的重点。 细胞生长是细胞对外在和内在信号响应的正向和负向调控之间微妙平衡的表现（面板2.34）。正向调控刺激细胞生长和增殖，抑制细胞死亡机制，而负向调控抑制生长并促进细胞死亡。来自环境的外部信号告诉细胞DNA复制和生物质合成所必需的营养物质和其他因素的可用性或缺失。同时，内部信号评估细胞的结构完整性和细胞分裂的生理准备情况，并调节细胞程序以增加细胞成分含量、分裂或死亡。凋亡的调节与生长控制类似，通过促进和抑制凋亡的因素来响应细胞损伤的内部信号和发育线索的外部信号。 8.1.细胞周期和生长控制 真核细胞在其数量增长的努力中循环地经历四个阶段：G1、S、G2和M期（图2.19，面板2.35）。G1和G2指的是间隙阶段。S和M阶段分别来自DNA合成和有丝分裂的命名。这四个阶段构成了一个细胞周期，每次一个单细胞变成两个子细胞时都会重复。在G1阶段，细胞质量和细胞大小增加。其持续时间取决于培养的化学和物理环境。细胞还将检查内部和外部条件是否准备好进入细胞周期的下一个阶段，即S阶段。在进入S阶段之前，被认为存在一个限制点。只有当细胞条件正确，必要的外部正向有丝分裂因子可用，且负向抑制因子缺失时，细胞才会通过限制点并进入S阶段。例如，成纤维细胞的增殖需要PDGF（血小板衍生生长因子），上皮细胞和许多非上皮细胞需要EGF（表皮生长因子），红细胞前体需要EPO。锚定依赖性细胞进入S阶段还需要整合素与ECM之间的接触建立以及细胞骨架网络中的适当张力。与正向因子的作用相反的是那些提供信号导致生长停滞的因素。例如，TGFβ（转化生长因子-β）抑制许多细胞类型的增殖。锚定依赖性细胞生长到融合状态后的细胞-细胞接触导致生长停止。对于需要建立细胞-细胞接触以生长的细胞，细胞间粘附连接的解离破坏了细胞的内部信号网络并导致生长停滞。有丝分裂和细胞质分裂的过程对于哺乳动物细胞大约需要一个小时，而S阶段大约需要6个小时。虽然在不同的培养条件下翻倍时间（即细胞周期的一段时间）会改变，但G1阶段是最容易被延长的阶段。处于长时间静止状态的细胞，如终末分化细胞，从G1转向退出细胞周期并进入G0阶段。G0阶段可能存在两种不同的类型：一种休息状态允许细胞最终重新进入细胞周期并增殖，或者是一种已永久关闭细胞周期重新进入机制的状态。例如，体内处于永久G0阶段的终末分化细胞，如神经元细胞。在体内和培养中处于氨基酸饥饿条件下的成纤维细胞进入休息的G0阶段。它们可以在适当的条件下重新进入G1阶段并恢复生长。 图 2.19. 哺乳动物细胞的细胞周期。 在S阶段，DNA复制发生。有机体体细胞中的DNA复制具有非常高的保真度，在染色体的序列水平和宏观结构水平上都是如此。我们体内的所有>1012细胞基本上具有相同的基因组序列和染色体组织。在S阶段结束时，一个细胞已经复制了其基因组或DNA内容，顺序正确，错误率极低。对于某些癌细胞或培养中的细胞系来说，情况可能并非如此。例如，在DNA序列水平上，与基因组的其余部分相比，CHO细胞中的基因组DNA片段可以看到增益或丢失副本。当从克隆中衍生出已知具有非整倍体核型的CHO细胞时，它们最初具有相同的染色体组织。然而，几代之后，它们的后代具有非常不同的染色体数量和组成。 在G2阶段之后，复制的基因组以两组染色体的形式，在M阶段（称为细胞质分裂）中分离。随着细胞核分裂成两个，每个细胞核都接收到构成二倍体基因组的一组染色体。随后，细胞质材料和细胞核被分配到两个子细胞中。细胞质分裂的过程具有非常高的保真度。然而，在连续细胞系和癌细胞中并非如此。这些异常细胞中DNA合成和修复的错误导致异常染色体的产生，而细胞质分裂中的错误导致不同细胞具有不同组成的染色体（即异常核型）的异质群体。这种基因组复制控制的缺乏保真度是这些细胞特性的一部分。在分离单个细胞以开始新的细胞群体之后，即使整个群体来自单一祖先核型，群体的染色体组成再次变得异质。 细胞周期蛋白和CDKs 通过细胞周期（G1、S、G2和M）的进展是由细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）正向调节，并由CDK抑制因子（CDIs）负向控制。特定于阶段的细胞周期蛋白对于G1、G1/S、S和M阶段在细胞周期中上升和下降，并与不同的CDKs相互作用形成特定于细胞周期阶段的细胞周期蛋白-Cdk复合物。不同的细胞周期蛋白-Cdk复合物进一步通过激活和失活磷酸化以及与CDI结合在活性水平上进行调节。此外，细胞周期蛋白-Cdk复合物还受到蛋白水解调节（图2.20）。 图 2.20. 细胞生长调控与细胞凋亡调控之间相互作用的示意图。Cdk：细胞周期依赖性激酶，IRF1：干扰素调节因子1，RB：视网膜母细胞瘤蛋白，ERK：细胞外信号调节激酶，FADD：FAS相关死亡结构域蛋白，FLIP：FLICE抑制蛋白，EIF4E：真核生物翻译启动因子4E，Cyc：细胞周期蛋白，XIAP：交联抑制凋亡蛋白，APAF1：凋亡肽酶激活因子1，BAX：Bcl-2相关X蛋白，BAK：Bcl-2同源拮抗剂/杀手，Ub：泛素化，Cyt C：细胞色素C。 这些调节蛋白中的每一个都在整个细胞周期中显示出特征性的动态轮廓（图2.21）。细胞周期蛋白-Cdk复合物的活性轮廓是其组成部分的表达和相互作用的结果，这些部分进一步受到激活、失活和降解的调节，所有这些都按照节奏进行编排。重要的是，这种编排是动态的，能够响应环境线索，如营养物质的丰富或缺乏、DNA损伤或染色体分离紊乱。 图 2.21. 细胞周期不同阶段中细胞周期蛋白的动态表达。 在从G1到S阶段的过渡期间，一个重要的细胞周期检查点会出现。G1/S阶段转换中的关键角色是调节性视网膜母细胞瘤蛋白（Rb）和Cdk4/6-细胞周期蛋白D复合物（即G1-Cdk复合物）（图2.20）。在生长抑制或静止的细胞中，Rb未磷酸化并结合并抑制其E2F。E2F是一种转录因子，激活S阶段的细胞周期蛋白E和其他蛋白的转录。当处于与Rb结合的状态时，它抑制它们的转录。在生长因子和其他线索的刺激下，ERK（生长调节信号系统的关键角色）激活G1-Cdk复合物（通过像c-Myc这样的转录因子）磷酸化Rb。磷酸化的Rb从E2F上解离，导致细胞周期蛋白E的表达激活，进而推动Cdk2的激活和细胞周期蛋白E-Cdk2（G1/S Cdk复合物）的形成。E2F对Rb磷酸化的正反馈导致Rb的高度磷酸化和Cdk2的激活。S阶段细胞周期蛋白，细胞周期蛋白A，在G1阶段晚期开始积累，但被抑制剂结合。G1-Cdk复合物促进去除抑制以使S-Cdk复合物积累，标志着进入S阶段。 正常细胞严格遵循通过限制点的内部和外部条件的要求，但癌细胞和连续细胞系并非如此。用于治疗蛋白生产的几乎所有细胞系，包括CHO、BHK、HEK293和鼠骨髓瘤细胞，都失去了正常的生长控制。它们的细胞周期检查点控制已经受到损害，对有丝分裂原和细胞粘附复合物形成的要求已经放宽。然而，并非每个细胞系中负责生长控制放宽的分子机制都完全表征。CHO细胞有一个扩增的基因组区域，编码c-Myc基因，一个癌基因，以及一个突变的TP53，一个肿瘤抑制基因。基因TP53的产物，p53，将外部压力信号介导到细胞周期调节器以限制细胞周期。其基因组在DNA复制、删除和染色体重组方面也具有高度的结构异常。CHO细胞中导致其高度不稳定的生长行为（例如，生长因子和锚定独立性）的细胞周期控制中存在哪些额外的基因组变化仍不清楚。 8.2.程序化细胞死亡和凋亡 生物体中的大多数细胞死亡是受调节或程序化过程的一部分，而不仅仅是广泛损伤的结果。凋亡是响应发育线索或累积的非致命压力的受调节细胞死亡过程（面板2.36）。细胞可能因生物体的利益而被编程死亡的原因有很多。在某些发育事件中，生成的细胞数量超过了最终构成分化组织的数量，多余的细胞将经历凋亡并死亡。死亡的细胞随后被邻近细胞吞噬并消失。这在神经组织发育中可以看到，那里生成了大量的神经细胞。这些细胞需要数量有限的积极生存信号。那些接收到足够数量的积极信号的细胞存活下来构成神经组织，而那些没有接收到的则经历凋亡并死亡。一些细胞被生成只为了一段时间的功能。在它们超过预期的活动时间后，它们被编程为死亡。例如，像抗体产生的浆细胞和自然杀伤细胞这样的免疫细胞，为一段时间的功能服务，然后进入凋亡并死亡。被病原体感染和损伤的细胞也进入程序化细胞死亡，从而减少病原体向其他未感染细胞的传播。 程序化细胞死亡的类型传统上根据垂死细胞的形态变化进行分组，尽管近年来分子机制已经变得更加清晰。凋亡以特定的细胞形态变化为标志：线粒体膜破裂、DNA凝缩和碎片化、染色质收缩和膜膨胀。最终的细胞内事件涉及一系列导致细胞破坏的级联反应。在体内，死亡的细胞和碎片通常在它们完全破裂之前被邻近的吞噬细胞吞噬。第二种类型的细胞死亡，坏死，类似于坏死，即由损伤累积引起的细胞死亡。它以细胞质膜的破裂和细胞内容物的释放为标志，因此可能有助于炎症反应，如在免疫细胞的程序化细胞死亡中所见。 与发育事件相关的凋亡是通过将细胞外配体结合到细胞膜上的死亡受体来介导的，称为外在途径。另一条途径，内在途径，在细胞压力下激活，如营养耗尽、生长因子剥夺、病毒感染或代谢物积累。内在途径也被称为线粒体途径。压力诱导的细胞内信号激活内在途径，从而导致细胞死亡。 通过这两种途径的自我毁灭的最终行为在所有凋亡机制中都是相似的。然而，死亡受体途径和线粒体途径的启动“信号”是不同的（图2.20）。 外在途径 在许多发育事件中，单个细胞只服务有限的时间段。这些细胞被编程在达到功能寿命后进入凋亡。它们的生存依赖于积极因子的存在和消极效应因子的缺失。发育相关的凋亡主要由细胞表面的死亡受体调节。死亡受体途径是通过配体与死亡受体的结合来介导的。受发育调控的凋亡细胞在其表面表达死亡受体，例如Fas死亡受体。外部Fas配体与死亡受体的结合招募一个适配分子，Fas相关死亡域（FADD），到受体的细胞质端。FADD的存在导致前体caspase 8或9与死亡受体结合，形成一个死亡诱导信号复合物（DISC）。然后caspase被蛋白水解激活，触发一系列下游效应caspases（3、6和7）的激活。这些效应caspases的激活导致细胞破坏的最后阶段。 内在（线粒体）途径 除了在能量代谢中的作用外，线粒体也在凋亡的调节中起着关键作用。一些促凋亡蛋白被隔离在线粒体外膜和内膜之间的空间中。细胞色素C，一种与线粒体内膜相关的血红蛋白，是电子传递链中细胞色素C复合体的重要组成部分。在应激细胞中释放细胞色素C和那些促凋亡蛋白启动了凋亡的内在途径（图2.22）。释放到细胞质中的细胞色素C与APF1、前体caspase 9和dATP形成复合物，统称为凋亡体。在凋亡体中，不活跃的前体caspase 9被激活，并随后激活下游caspases。 图 2.22. 细胞凋亡的内在（线粒体）途径。 线粒体凋亡途径涉及正向促凋亡和负向抗凋亡因子。由20多个促凋亡或抗凋亡蛋白组成的Bcl-2家族是线粒体凋亡途径的主要角色。促凋亡亚家族包括BAX、BAK和BOK，它们都包含BH1、2和3同源结构域。暴露于死亡信号时，BAX经历构象变化并转移到线粒体，在那里它插入到线粒体外膜并形成通道。这些通道允许细胞色素C和其他促凋亡分子的泄漏。两个抗凋亡蛋白，Bcl-2和Bcl-xL，对抗促凋亡组分的作用。Bcl-2位于线粒体膜上，通过维持膜的完整性来抑制促凋亡分子从线粒体中的释放。Bcl-xL位于细胞质中，与Bcl-2家族的促凋亡成员结合。多个主角和拮抗因子的参与确保了凋亡事件的严格控制。 对于培养中的细胞，凋亡也会在一些应激条件下发生。通过化学手段或遗传改造来延迟凋亡并延长细胞培养的持续时间是诱人的。例如，已经探索了大量caspase抑制剂用于体外以及动物模型。在培养细胞中过表达抗凋亡基因已被证明可以延迟培养后期细胞活性的下降。 9.结束语 本章提供了对生物技术学家实践细胞培养过程所必需的细胞关键生物学特征的简明概述。细胞的结构和组成赋予了它们的功能多样性，但也限制了它们的能力。在利用它们的生物学多样性的同时，我们还必须了解细胞的结构和功能限制以及生物学限制。我们必须记住，细胞生物加工的目标是充分利用细胞的生物学潜力进行技术应用。为此，限制可能不受细胞性质的约束；相反，工程可以用来促进我们目标的实现。通过更好地了解细胞的能力和限制，我们将能够进一步推动技术边界。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

摘要:凋亡是一种程序化和受控的细胞死亡形式，它占生物加工过程中细胞死亡的大多数。细胞死亡影响培养的寿命和产品质量；它是由生物反应器内细胞经历的多种压力引发的。了解导致凋亡的因素以及开发能够保护细胞的策略对于稳健的生物加工开发至关重要。本综述旨在：a) 从生物加工的角度探讨凋亡；b) 描述重要的凋亡机制，并将它们与生物反应器中遇到的最相关的压力联系起来；c) 讨论设计操作条件以避免细胞死亡；d) 聚焦于工业相关的细胞系；以及 e) 提出包括细胞工程和基于模型的生物加工优化在内的抗凋亡策略。此外，还强调了凋亡在从克隆筛选到生产规模的质量设计生物加工开发中的重要性。 1.引言 在快速增长和竞争激烈的生物制剂市场中，生物加工优化至关重要。一个优化的生物加工将涉及高产细胞培养和最小的凋亡压力。培养活性对于确定培养寿命至关重要，通常由活性截止点决定，超过该点产品质量将受到影响。存在三种主要的细胞死亡途径：坏死、自噬和凋亡。据报道，凋亡是所有工业相关细胞系中死亡的主要原因，在中华仓鼠卵巢（CHO）细胞中占细胞死亡的80%和TB/C3杂交瘤细胞培养中的90%。阐明凋亡及其构成机制对于提高培养寿命和产品滴度，同时保持高产品质量至关重要。本综述着重于与凋亡相关的生物加工开发挑战，通过：a) 介绍凋亡细胞死亡的主要机制；b) 检查各种生物加工变量和操作条件对凋亡压力的影响；c) 确定影响生物加工的压力；以及d) 讨论两种方法——细胞系工程和凋亡建模——作为传统基于实验的方法的替代，用于最佳操作设计（图1）。 图1. 凋亡的生物过程策略：a) 传统方法，基于实验优化培养条件，b) 细胞系工程方法，旨在产生抗凋亡细胞系，以及 c) 虚拟方法，将生物学机制整合到数学模型中，以实现基于模型的优化。 2.细胞死亡的生物学 2.1.凋亡的生物学 在凋亡中，内部和/或外部刺激引发一系列高度控制的反应，最终导致细胞死亡。参与凋亡的两组最重要的蛋白质，半胱天冬酶和Bcl-2（B细胞淋巴瘤2）家族蛋白，参与所有凋亡细胞死亡途径。半胱天冬酶是依赖半胱氨酸的内切蛋白酶，催化肽键的断裂。大多数半胱天冬酶以单体形式产生，活性很小或没有活性，通常称为前半胱天冬酶或酶原。激活后，它们同源二聚体形成生物活性蛋白。在小鼠或人类细胞中已报告有14种半胱天冬酶（编号1至14），对生物加工很重要。此外，还在小鼠或人类以外的哺乳动物细胞基因组中鉴定出四种其他半胱天冬酶（编号15至18），其中半胱天冬酶16是一个假基因（不翻译）。大多数半胱天冬酶可以根据其作用分为三组：a) 起始半胱天冬酶（半胱天冬酶8和9）；b) 执行者半胱天冬酶（半胱天冬酶3、6和7）；c) 参与炎症的半胱天冬酶（半胱天冬酶1、4、5、11和12L）。半胱天冬酶-2没有被分类，因为它与起始和执行者半胱天冬酶共享结构元素，是半胱天冬酶3和8的已知底物，也可以通过激活细胞色素C释放来触发凋亡体的形成。半胱天冬酶-2也可以被p53的下游靶标激活。半胱天冬酶-10的作用尚未完全阐明，它由半胱天冬酶-6激活，以及半胱天冬酶12S和14也仍未分类。半胱天冬酶级联反应一旦被触发，就会自我催化，如图2所示。 图2. 凋亡途径概述。已确定的五条主要途径包括：(1) 由外部刺激激活的外源性途径；(2) 由Bax通道促进的MOMP激活的内源性途径（Taylor等人，2008年）；(3) DNA损伤诱导的依赖caspase-2的途径；(4) 由Granzyme B诱导的途径，其中该分子作为caspase-3的诱导剂；以及 (5)由Granzyme A诱导的途径，其中不涉及任何caspases - Granzyme A诱导一种DNase，该酶诱导DNA片段化和细胞死亡。 Bcl-2家族蛋白（图2）在凋亡调节中起着重要作用，具有促进和抑制凋亡的活性，可以分为三个亚组。抗凋亡组包括Bcl-2、Bcl-xL（B细胞淋巴瘤超大）、Bcl-W（Bcl-2样蛋白2）、Mcl-1（诱导髓样白血病细胞分化蛋白）、Bcl2A1（Bcl-2相关蛋白A1）和Bcl-B（与Boo蛋白氨基酸序列相似的Bcl-2样蛋白）。这些蛋白有四个Bcl-2同源结构域（BH1、BH2、BH3和BH4）。除了Bcl2A1，所有其他成员都有跨膜结构域，通常与细胞、核或线粒体膜相关联。第二组由Bax（Bcl-2相关蛋白X）、Bak（Bcl-2同源拮抗剂杀手）和Bok（Bcl-2相关卵巢杀手）组成，缺乏BH4结构域。最后，第三组只有BH3结构域，由Bik（Bcl-2相互作用杀手）、Hrk（Harakiri）、Bim（Bcl-2样蛋白11）、Bad（Bcl-2相关死亡促进因子）、Bid（BH3相互作用域死亡激动剂）、PUMA（p53上调凋亡调节因子）、NOXA（Phorbol-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯诱导蛋白1）和Bmf（Bcl-2修饰因子）组成。BH4缺乏和仅有BH3结构域的蛋白在过表达时是促凋亡的。 已确定五种主要的凋亡途径，其中提出了多种途径。外源途径（通常称为类型I）由细胞外部刺激触发。死亡配体（如FasL或肿瘤坏死因子α，TNFα）与细胞膜上的受体结合，触发半胱天冬酶-8的激活，从而启动凋亡（图2）。内源途径（通常称为类型II或线粒体途径）由内部刺激（代谢或缺氧压力）激活，也可以由内质网应激触发。凋亡类型II触发的内部刺激促进半胱天冬酶和Bcl-2家族的促凋亡成员的激活（图2），通过Bax通道导致线粒体外膜通透性（MOMP）增加。Bax激活SMAC（线粒体来源的第二种半胱天冬酶激活剂），抑制XIAP（X连锁凋亡抑制蛋白）的抗凋亡活性。反过来，MOMP导致细胞色素C的释放，这诱导了凋亡体的形成，由七个半胱天冬酶-9单元组成的复合体。半胱天冬酶-9将触发一个执行者半胱天冬酶（3或7），确保过程的连续性。Bcl-2家族的抗凋亡成员（例如Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1）能够通过抑制其促凋亡对应物的活性来抑制凋亡。在这个过程中，外源途径的激活也可以通过半胱天冬酶-8激活Bid发生。相反，外源途径作为内源途径的下游效应可能在p53激活CD95时发生。第三种途径依赖于半胱天冬酶-2的存在，它可以在持续DNA损伤时被肿瘤抑制基因p53激活。凋亡也可以通过Granzyme B直接激活半胱天冬酶-3触发。最后，由Granzyme A促进的DNA片段化也可以导致凋亡。对CHO细胞的蛋白质组学研究表明，内源途径是培养中最重要的凋亡驱动因素。它可以直接与生物反应器的操作条件联系起来，使其在生物加工中很重要，因为它可以被营养物质缺乏、过量蛋白质生产、温度或pH变化和高渗透压等触发。 凋亡的调节是通过蛋白质-蛋白质相互作用实现的，可能涉及第三个蛋白质作为介导。没有介导的蛋白质-蛋白质相互作用的例子包括Bax蛋白的BH3结构域产生四聚体，在线粒体膜上形成通道，或Bcl-2抑制Bax通道形成。相比之下，Bcl-2或Bcl-xL与半胱天冬酶-8之间的相互作用需要BAP31（Bcl-2相关蛋白31）的介导。内源途径导致由线粒体膜上的Bax通道或钙离子引起的线粒体外膜通透性（MOMP）。MOMP反过来会导致许多促凋亡分子的释放，如细胞色素C。如图2所示，半胱天冬酶-3在凋亡中起着重要作用，可以由起始半胱天冬酶8和9或Granzyme-B激活。一旦激活，它会反激活上游半胱天冬酶以确保过程的连续性。半胱天冬酶-3也是CAD（半胱天冬酶激活的DNase）的激活剂，它在增殖细胞中与其抑制剂形成复合体。当半胱天冬酶-3过表达时，该复合体会被切割，CAD降解染色体DNA，当聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）被半胱天冬酶-3（或7）抑制时也会发生这种情况。在晚期凋亡期间，半胱天冬酶-3作为细胞骨架重组和解聚诱导剂，导致凋亡小体的形成。尽管半胱天冬酶-3被认为是凋亡中必不可少的，但已经表明不表达半胱天冬酶-3的人类MCF-7乳腺癌细胞仍然可以经历凋亡。实际上，已经鉴定出一种由Granzyme A介导的半胱天冬酶独立途径，其中Granzyme A诱导DNA片段化导致细胞死亡。 在凋亡过程中，细胞的几种结构特征会发生变化：许多细胞骨架成分被降解导致膜泡形成；核层被破坏导致核膜塌陷、DNA片段化和染色质浓缩；形成含有完整细胞器的凋亡小体，随后被巨噬细胞降解；线粒体膨胀和伸长。尽管这些特征中的一些可以通过光学显微镜观察到，但这种技术不如流式细胞仪准确，流式细胞仪通常更受青睐用于凋亡监测。流式细胞仪已被用于分析DNA、RNA、线粒体膜电位和细胞膜完整性，两种染料的组合，荧光素-Annexin V和7-氨基放线菌素D（7AAD），已用于区分活细胞、早期凋亡、晚期凋亡和死亡细胞。在某些条件下，凋亡可以逆转，如在多种细胞系中去除凋亡刺激后报道的那样。还有人提出DNA损伤诱导p53（一种肿瘤抑制基因），反过来同时诱导DNA修复、细胞周期停滞和凋亡停滞。此外，即使在由促凋亡蛋白诱导DNA损伤后，晚期凋亡也可能是可逆的。Anastasis（希腊语意为“复活”）被提议为细胞“复活”过程的名称。建议的逆转机制需要一组几种蛋白质，逆转凋亡后观察到一些遗传变化，包括染色体畸变和数量。 2.2.其他形式的细胞死亡 尽管凋亡是哺乳动物细胞培养中主要的细胞死亡形式，其他机制，特别是在细胞培养后期，也可能有所贡献。这些包括自噬和坏死性凋亡，下面简要描述（图3）。自噬是一种将细胞质物质运送到溶酶体进行降解的细胞死亡形式。尽管自噬被认为是一种细胞存活机制，但最近的研究表明自噬可以促进细胞死亡。在自噬过程中，隔离膜形成，通常位于线粒体/内质网接触区域。Beclin-1和液泡蛋白分选34（VPS34）促进隔离膜的成核；几个细胞器可能被招募到这种生长膜的内侧，包括线粒体、高尔基体和内质网。蛋白质轻链3（LC3）通过一组自噬相关蛋白（ATG）附着在隔离膜上。LC3将促进识别自噬体，然后与溶酶体融合以破坏细胞成分。这种细胞死亡形式最初由Hwang和Lee在葡萄糖和谷氨酰胺缺乏时在CHO细胞培养中观察到。自噬可能通过ATG5激活半胱天冬酶-8触发外源途径的凋亡。有趣的是，抗凋亡蛋白Bcl-2也是Beclin-1的抑制剂。虽然这种相互作用阻止了自噬，但它并不抑制Bcl-2的抗凋亡作用。BH3-only蛋白抑制Bcl-2/Beclin-1相互作用，从而促进自噬。一个例外是BIM，它将Beclin-1错误定位到动力蛋白轻链1（DLC1），阻止自噬。自噬也可能在凋亡的终末阶段通过Beclin-1切割被半胱天冬酶-3抑制，如图3A所述。另一种越来越受关注的细胞死亡形式是坏死性凋亡。当死亡受体被配体激活时，受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）被激活。这种蛋白反过来激活RIPK3，触发坏死性凋亡。由这些（RIPK1和RIPK3）和其他蛋白质形成的复合体称为坏死体，已知它能抑制糖原分解和谷氨酰胺分解，最终减少能量代谢。细胞内ATP总体减少导致坏死性凋亡死亡。这条途径不仅与半胱天冬酶无关，而且还受到半胱天冬酶的抑制；半胱天冬酶-8抑制RIPK1和RIPK3的相互作用，从而防止坏死性凋亡，如图3B所述。 图3. 其他细胞死亡机制。细胞培养中发生的其他形式的细胞死亡包括自噬（A）和坏死（B）。 总之，细胞死亡，特别是凋亡，在生物加工中具有显著影响，影响细胞活性、生产力和产品质量。上游工艺开发应考虑凋亡监测和尽可能避免凋亡的策略开发，而不是试图逆转它。这需要深入了解跨尺度的相关促凋亡压力以及如何最小化这些压力。这是下一节的范围。 3.生物加工开发过程中的凋亡压力 3.1.不同尺度上的凋亡 上游工艺开发的第一步是选择一个合适的克隆，通常基于生长和生产力。虽然克隆选择发生在微升级别，但在生物加工开发过程中，规模将逐渐增加到立方米级别的生物反应器。在这些步骤中，凋亡压力的性质不同，它们对生长和生产力的影响也不同。为了实现最佳操作条件，重要的是准确识别相关压力及其原因，理解细胞响应机制，并在生物加工开发的各个阶段消除/逆转凋亡（图4）。在摇瓶或微孔板尺度上，由于不进行搅拌，运输是由于扩散和轨道混合，凋亡压力主要由克隆选择中使用的有毒试剂所主导。两种广泛使用的试剂是无谷氨酰胺培养基用于谷氨酰胺合成酶（GS）基础选择和甲氨蝶呤（MTX），如果使用二氢叶酸（DHFR）系统。MTX也是一种已知的凋亡诱导剂，能刺激PUMA。当生长速率和生产力成为克隆选择的关键标准时，确保pH值、温度、营养物质耗竭和渗透压不抑制生长或触发凋亡变得至关重要。即使在小规模上，扩散足以确保均匀环境，由于计划维护/取样任务在孵化器外进行，除非采用自动化系统，否则可能会发生压力温度波动。随着规模的增加，扩散不再能够维持有效的物质运输，宏观环境变得越来越不均匀，需要混合系统，这是剪切应力的来源。与规模放大相关的另一个问题是提供足够的氧气。在大型生物反应器中，这通常是通过从底部通气来实现的，这可能会产生额外的剪切应力。相比之下，大规模的温度控制不是一个主要问题。由于生物加工开发包括不同的操作模式，必须注意考虑与规模相关的效应。为了最小化放大问题，从克隆选择阶段就使用微型搅拌罐系统。 图4. 不同尺度的凋亡应激。上游生物过程开发识别重要的流程和生物反应器参数以及各个生物过程尺度上的相关凋亡应激和途径。 3.2.生物反应器中的凋亡压力 本节讨论与生物反应器相关的压力，如缺氧、剪切、营养物质缺乏、温度、pH值、渗透压和蛋白质错误折叠，将与每种特定压力相关的细胞生物学联系到产品质量、生物加工变量和操作条件。重要的是要提到，不同压力的影响可能因使用的培养系统而异。灌注系统，例如，允许营养物质的供应和副产品的去除，减少代谢压力。然而，由于实现了更高的细胞密度，培养粘度的相应增加导致pH值、渗透压和剪切应力的增加，这些在分批培养中观察到的。 3.2.1.缺氧压力 氧气在哺乳动物细胞代谢中至关重要，是需氧能量代谢中的最终电子受体。在缺乏氧气的情况下，采用厌氧代谢进行能量生产，导致有毒代谢产物的产生，最终导致细胞周期停滞和凋亡。因此，能量消耗减少，分泌生存因子，如低氧诱导因子（HIFs），在调节细胞对缺氧的反应中起着关键作用。HIFs是具有α（O2-labile）和β（稳定）亚基的异二聚体蛋白。在正常氧水平下，α亚基通过脯氨酰羟化酶（PHDs）在两个保守的脯氨酸残基上羟化，标记HIFα进行蛋白酶体破坏。在缺氧条件下，PHDs活性降低，HIFα不被抑制，诱导缺氧反应基因。事实上，PHDs已被提议作为负责HIF对氧浓度反应的氧气传感器。对缺氧诱导的凋亡的反应可以根据线粒体感知的氧水平重新编程，导致产生活性氧（ROS），降低PHDs。确保氧气不是限制因素在生物反应器设计和放大中至关重要。氧传递系数（kL）和气泡表面积（a）的乘积，通常表示为kLa，用作衡量通气效率的指标。kLa与混合引起的能量耗散率成正比；确保高kLa和低剪切应力环境可能具有挑战性，特别是在哺乳动物细胞培养中实现的越来越高的细胞密度。关于氧气对哺乳动物细胞培养影响的文献综述见表1。 在摇瓶和控制生物反应器中的CHO细胞研究表明，与摇瓶培养不同，生物反应器培养没有经历缺氧，缺氧导致蛋白质表达减少。在50L生物反应器中也获得了类似的结果，其中溶解氧从60%降低到15%的空气饱和度导致寿命减少和蛋白质运输，从而影响生产力和滴度。尽管通过补充金属离子可以维持活力和生产水平，但这种策略对产品质量的影响没有报告。这将特别有趣，因为已经证明金属离子在糖基化中起着重要作用。尽管在CHO细胞生物学中起着重要作用，但缺氧本身不会导致死亡，除非氧分压降低到零或其他因素参与。即使当氧分压降低到2x10-4巴，细胞生长停止，也可能不会观察到细胞死亡。然而，当缺氧与pH值6-6.5结合时，会观察到时间和pH依赖的细胞毒性效应。在这些条件下，由于pH（独立于氧水平）导致的葡萄糖消耗和乳酸产生减少，并且在两种压力结合下ATP水平降低了85%，而单独任一压力对能量产生没有影响。在GS-NS0培养中观察到类似的效应，在缺氧12小时后，细胞周期在G2期（9小时）停止，随后是G1和S期的停止，并且mAb生产停止。报道了降低能量密集型过程（如DNA合成）和激活能量产生和氧气输送过程。这些研究表明，缺氧压力效应的某些方面在细胞系间是保守的。在产品质量方面，血清自由培养的CC9C10杂交瘤细胞中观察到缺氧的负面影响，其中观察到IgG1糖基化的不足。作者推测，糖基化不足可能是由于UDP-Gal核苷糖供体的可用性降低。还观察到增加的抗氧化酶活性，为活性氧提供了证据。总之，缺氧诱导的生长停滞似乎是细胞系独立的，对于低于1%的缺氧水平。需要更多的研究来完全阐明缺氧对产品质量的影响，这也将有助于在工艺开发过程中的质量设计。 3.2.2.剪切应力 剪切应力是由搅拌器和挡板产生的，它们被用来在生物反应器内实现均匀性，或者通过通气产生，这可能会产生剪切应力，直接导致细胞破裂，因为气泡在上升到气液界面时破裂。与通气相关的剪切应力随着气泡直径的减小而增加。使用表面活性剂，如Poloxamer F68，显著降低了细胞与气泡之间的表面张力，减少了剪切对培养活性的影响。然而，重要的是要确保消泡剂不影响细胞生长和产品质量，并且它们可以在下游处理中有效去除。剪切应力影响的其他培养参数包括单克隆抗体（mAb）生产、葡萄糖消耗和乳酸产生，这些参数以不受规模影响的方式受到影响。关于生物反应器内部剪切应力的流体动力学来源的详细概述，包括湍流、边界层和碰撞效应，见其他地方。一般来说，在大多数培养时间内，生物反应器内部经历的剪切应力水平低于诱导凋亡所需的水平。此外，抵抗力和可容忍的压力水平取决于细胞系、几何形状和操作条件。表2总结了剪切应力在工业相关细胞系中的影响。 CHO细胞可以耐受比Sp2/0细胞更高的剪切应力水平，然后才会观察到对生长或生产力的负面影响。随着工艺的放大，混合系统的设计必须确保细胞不会长时间暴露在高水平的压力下，据估计（在搅拌器周围经历的）仅发生在生物反应器体积的约5%或在良好混合反应器中的5%时间内。反应器的不均匀性和长时间暴露在高剪切下会以剂量和时间依赖性的方式影响细胞培养。在HDP1杂交瘤中，暴露于60 Pa（600 dyne/cm2）45分钟后观察到活性下降50%，而在20 Pa（200 dyne/cm2）下观察到类似的减少需要2小时。类似地，CRL-8018杂交瘤在暴露于50 dyne/cm2下10分钟后活性下降50%，在30分钟后下降80%。挡板是剪切应力的另一个来源，因为它们通过增加能量耗散率5倍。尽管从理论上讲，挡板可以被消除，但它们在防止涡流形成方面至关重要，涡流是剪切相关细胞死亡的主要原因。挡板的数量和位置体现了防止涡流和产生剪切应力之间的权衡。在设计混合系统时，应保持低能量耗散率；能量耗散率约为2-3x105 W/m3（>700 rpm）会在CHO细胞中诱导凋亡，而能量耗散率为1x108-1x109 W/m3会导致CHO细胞破裂。这些值在存在气相的情况下可能会改变，这将促进涡流、气泡夹带和气泡破裂，从而增强剪切应力，因此必须降低搅拌速率。事实上，当消除2L生物反应器中的气相空间时，CHO细胞在600 rpm下搅拌没有经历显著损伤，这与Mollet等人的估计一致。有趣的是，这些结果与高速搅拌下搅拌器设计和分布器位置无关，而在搅拌速率较慢时，分布器的位置起着更重要的作用。 已经假设细胞抵抗剪切应力的能力随着特定细胞系的培养历史而变化，而在T型瓶或低搅拌spinner flasks（低水平流体应力）中培养的杂交瘤比在高搅拌下培养的杂交瘤对剪切更敏感。然而，野生型和Bcl-2缺陷CHO细胞对剪切的抵抗力被发现与它们之前在T型瓶或悬浮培养中的培养无关。这一观察归因于细胞暴露于剪切时Bcl-2表达的丧失。还报告了基因表达损失，其中在5L生物反应器中培养的CHO细胞显示出较低的F-肌动蛋白表达水平，导致细胞骨架较弱。相反，Perani等人观察到Bcl-2确实在三个几何不同的系统中培养的NS1衍生的小鼠杂交瘤中提供了凋亡保护。这些不同的发现表明，剪切应力抵抗力是细胞系特定的。 3.2.3.营养物质/代谢物压力 限制生长的营养物质是细胞系和克隆特定的；确定它们对于设计合适的培养基和补充培养基进行分批和连续培养至关重要。几项研究已经检查了营养物质和代谢物对细胞生理学的影响，如表3所总结的。生长限制性营养物质的耗尽导致生长停滞，最终导致凋亡，这也由有毒代谢物的存在引起。葡萄糖作为重要的碳源，在调节凋亡方面至关重要，但其重要性可能更多的是调节性的而不是营养性的，这已通过使用GS-NS0细胞的研究建议，其中葡萄糖调节并延长了静止期，以及调节DNA修复和转录。此外，葡萄糖可以通过快速提供ATP来防止或延迟凋亡。除了主要的碳源（通常是哺乳动物细胞的葡萄糖），氨基酸非常重要，不仅作为蛋白质生产的构建块，还作为三羧酸（TCA）循环中间体的前体。 了解细胞系和克隆特定的氨基酸代谢使能够确定培养过程中必需营养物质的代谢转变，应避免这些转变，因为它们可能会影响生长、生产力和产品质量，导致制定适应所用细胞系/克隆特定需求的培养基和喂养策略。如果代谢发生变化，纠正措施可能不会产生预期的效果。在氨基酸中，谷氨酰胺已被证明与CHO培养中的乳酸代谢转变相关，从而也影响培养pH。包括任何代谢转变信息的详细代谢分析对于理解这些观察至关重要。 除了糖或氨基酸之外的其他必需营养物质包括蛋白质，如胰岛素和转铁蛋白，其撤除导致CHO细胞凋亡，以及磷，添加到高细胞密度NS0培养中成功防止活性损失，增加mAb滴度和抑制凋亡。另一组必需分子是脂质。当营养物质耗尽时，某些细胞系能够通过合成三酰甘油和形成脂滴来维持活性。目前对这种现象的了解不足，但已经表明在完全营养物质耗尽的情况下，CHO细胞能够通过β-氧化脂肪酸生存，这需要脂滴生物生成。 随着细胞的生长和营养物质的代谢，它们产生副产品，这些副产品变得有毒并导致凋亡。两个重要的有毒代谢物是乳酸和氨，分别是葡萄糖代谢和谷氨酰胺/天冬酰胺代谢的副产品。当葡萄糖从更高效的TCA循环转向更快的发酵途径时，会形成乳酸。如果氧气不可用，就不能进行氧化磷酸化，细胞将通过替代途径代谢葡萄糖，例如乳酸发酵，产生乳酸。乳酸产生速率取决于克隆，受培养基配方的强烈影响。乳酸积累最终可能导致代谢转向乳酸消耗，尽管如此，仍然会导致生长停止和活力下降。此外，当乳酸脱氢酶A（LdhA）和丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）1、2和3同时低表达时，CHO细胞中mAb产量增加，当丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）被化学抑制时也是如此。乳酸对哺乳动物细胞培养的影响已与乳酸积累导致的氧化磷酸化速率下降相关。尽管在几项研究中被识别，但并非所有CHO克隆都观察到乳酸代谢转变。即使在同一项研究中，这也是细胞系和克隆特异性属性。有趣的是，从培养基中摄取谷氨酰胺的细胞中可能发生的乳酸代谢转变与谷氨酰胺的存在相关，这表明谷氨酰胺分解可能促进乳酸产生。然而，由于乳酸存在时线粒体氧化途径活性降低，代谢并未恢复正常。乳酸消耗另一个重要作用是再生糖酵解所需的NAD+辅因子。表达丙酮酸羧化酶的CHO细胞的分批培养表明，尽管观察到乳酸代谢转变，但培养寿命仅延长了1天（从10天延长到11天），尽管达到了更高的细胞密度。值得一提的是，这一现象可能受温度影响。在33°C培养的HFN 7.1杂交瘤中，即使谷氨酰胺完全消耗，乳酸生产仍在继续导致细胞死亡。然而，当相同细胞在37°C培养时，谷氨酰胺耗尽时乳酸生产停止。作者团队的未发表结果显示，在无谷氨酰胺、化学定义的培养基中分批培养的GS-NS0细胞产生的乳酸很少（<4mM），这可以归因于这些细胞在无谷氨酰胺的培养基中生长，并且只会产生它们所需的谷氨酰胺量（来自谷氨酸）。然而，另一种在分批培养中消耗乳酸的GS-NS0细胞系直到谷氨酰胺（最初不出现）达到0.4mM才开始消耗乳酸。只要保持谷氨酰胺浓度低，乳酸浓度就保持稳定，当谷氨酰胺浓度仅增加时就会产生乳酸。对于可以将乳酸和谷氨酰胺代谢联系起来的细胞系，培养基设计的一个重要限制是确保将谷氨酰胺浓度保持在最低以避免乳酸产生。控制谷氨酰胺水平也很重要，以避免产生氨。氨是谷氨酰胺代谢的副产品，与乳酸相反，它将培养pH值转变为碱性值。氨在2.5mM、6mM和高达29mM的浓度下分别对杂交瘤、HEK 293和CHO细胞培养产生负面影响。此外，氨的产生可能是细胞系和克隆特异性的。使用GS-NS0细胞进行的工作报告了不同水平的氨，从低于1mM到接近6mM。 3.2.4.温度 哺乳动物细胞生长、蛋白质生产和生化反应由酶催化，其活性受温度影响。生物加工规模与哺乳动物细胞生物加工开发中的温度控制相互关联。在小规模，直到台式生物反应器，温度控制是在受控环境中实现的，例如在孵化器中，而随着规模的增加，需要冷却和/或加热系统来控制温度并避免温度曲线的显著偏差。关于温度对哺乳动物细胞培养影响的分子机制有大量文献。具体来说，与热休克诱导的凋亡相关的转录独立的p53、钙失调和Bax具有调节作用。热休克蛋白70（HSP70）通过几种可能的机制参与保护免受温度诱导的凋亡。 在CHO细胞中，HSP70很重要，因为它延迟了半胱天冬酶-3的表达。鉴定了200多种具有温度依赖性表达谱的蛋白质，其中118种上调，与生长、凋亡和糖蛋白质量控制直接相关的23种蛋白质与温度降低直接相关。几项研究表明，高于最佳温度（37°C）的培养温度会触发凋亡。在CHO细胞中，过表达HSP27和HSP70导致由于在37°C时延迟表达半胱天冬酶2、3、8和9而增加了寿命。尽管报告了产品滴度的增加，但未描述产品质量属性和遗传稳定性，也未证明这种策略是否会改善更高温度下的CHO培养。事实上，在39°C培养CHO细胞增加了生长速率，但导致G2/M期细胞周期停滞，活力和生产力下降，尽管整体产品滴度增加。在NS0细胞中，转染HSP70基因的克隆也导致对凋亡的抵抗力增加。野生型NS0细胞中缺乏HSP70表示细胞系对温度诱导凋亡的特异性反应。在产品质量方面，CHO细胞生产的Epo-Fc融合蛋白的唾液酸化在37和39°C之间没有显著差异。在几种杂交瘤中，37°C以上的培养温度对mAb生产不利。具体来说，这种效应在39°C和38°C的杂交瘤细胞培养中观察到。有人建议温度的效应可能是搅拌依赖的，因为非搅拌杂交瘤培养在38°C（与37°C相比）时具有更快的特定生长速率，产生mAb的速率相似；搅拌培养的情况正好相反，在38°C时生长较慢，产生mAb的速率较低。 低于最佳温度的温度也会影响培养寿命、细胞生长和生产力。在CHO培养中，单克隆抗体的聚集在33°C时比37°C高2到5倍。当生产双特异性抗体的CHO细胞的温度从36°C降低到32.5°C时，也观察到相同的效应。在这种情况下，重要的是确保细胞产生所需的双特异性mAb，而不是截短版本或完整的单特异性mAb。降低温度降低了生长，但促进了所需双特异性mAb结构的形成；尽管在较低温度下也观察到聚集，但总体上认为降低温度是有益的。建议采用两阶段培养策略，即在36°C进行生长，在32.5°C进行mAb生产，提高整体产品质量和下游处理产量。这些观察是细胞系和产品特异性的。在表达人类组织型纤溶酶原激活剂（tPA）的CHO细胞中，将温度从37°C降低到30°C在指数生长期增加了细胞周期抑制剂2A（细胞周期停滞诱导剂）的表达，对DNA损伤响应基因没有影响，尽管相应的基因没有上调，但tPA生产率增加（未提供产品质量数据）。此外，与能量产生和凋亡保护相关的基因上调，葡萄糖和乳酸的代谢速率减慢，而谷氨酰胺消耗保持不变。 在低温（30°C）条件下，CHO细胞的代谢速度较慢与G0/G1期阻滞有关。Trummer等人报告了产品质量数据，并显示唾液酸化减少了40%。对NS0细胞的研究表明，将温度从37°C降低到34°C可以在不影响培养寿命的情况下略微提高单克隆抗体（mAb）的产量。进一步将温度降低到22°C则显示无增殖并诱导凋亡，同时细胞周期在G2/M期被阻滞。尽管有DNA微阵列证据表明，在低温条件下培养细胞会停止代谢并诱导凋亡，但据我们所知，还没有研究报告低温诱导凋亡的详细机制。 3.2.5.pH值 在哺乳动物细胞培养中，严格的pH控制至关重要，因为即使是微小的偏差也可能导致细胞死亡。此外，pH值影响生长、单克隆抗体（mAb）产量、多种氨基酸的摄取率以及产品质量，如表5所示。尽管pH值很重要，但其在凋亡中的作用机制尚未完全阐明。 尽管最佳pH值取决于细胞系，但在哺乳动物细胞生物加工中，接近7.0的pH值通常被认为是理想的。在pH 6.8下培养CHO细胞对培养寿命最有利，而最大细胞密度在pH 6.9下获得。在所有评估的pH条件下，主要碳源（葡萄糖）的耗尽导致显著的活性下降和代谢转向乳酸消耗。Brunner等人表明，即使是短期的pH扰动也会影响细胞生理，而Trummer等人则表明，尽管在pH 6.8下获得了最高的单克隆抗体滴度，但在pH 7.1下达到了最高的体积生产力。尽管Trummer等人没有观察到pH 6.8和7.1之间产品质量（Epo-Fc的唾液酸化）的显著差异，但Brunner等人报告了在pH 6.8、7.0和7.2下培养的mAbs的基本和酸性变体中的几种差异。在另一项研究中，CHO灌注培养中第9天将pH从7.15降至6.85，增加了细胞密度和寿命，并改善了单克隆抗体的糖基化和效力，同时保持了生产力。 对其他细胞系也观察到了类似的效果。在Sp2/0补料分批培养中，中性pH最理想，当pH从7.2降低到7.0时，活细胞的积分和滴度都有所增加，尽管没有报告产品质量数据。在F2N78细胞培养中，pH从6.8增加到7.4会减少寿命并加速代谢，导致副产品积累更多，pH 6.8被认为是最佳选择。Osman等人受到在添加碱/酸时对生物反应器进行pH扰动的调查的启发，将GS-NS0细胞在pH 7.3下培养，并研究了单一和多重pH扰动的影响。作者报告说，单一pH 8扰动没有显著的不利影响，但对pH 9扰动有时间和剂量依赖性的反应。因此，有效的搅拌和谨慎选择添加碱/酸的点对于避免生物反应器非均匀区域的凋亡很重要。 如上所述，有毒代谢物（如乳酸）的积累会降低培养pH值。虽然在某些研究中，酸化是早期凋亡的特征，与DNA损伤有关，但在其他研究中，酸化并未导致细胞死亡，也没有影响生长，Bcl-2和Mcl-1提供了保护。在NS0细胞培养中，凋亡可以独立于细胞内pH变化发生，在酸度下HL-60细胞中观察到增加的半胱天冬酶活性。事实上，Bax在pH 4.0时形成线粒体膜孔的能力是在pH 7.5时的8倍，而Bcl-2几乎可以完全抵消这种效果。由于氨的产生，培养基的碱化是一个已知的增殖过程特征。然而，其对细胞生理的影响机制仍需阐明。碱性环境可能会抑制半胱天冬酶-3，但如果之前已经激活，蛋白质在pH值增加后仍然保持活性。 3.2.6.渗透压 关于渗透压的研究评估了盐分和代谢物对生长和生产力的影响，如表6所总结。尽管高渗透压在CHO细胞中激活了半胱天冬酶3和7，导致DNA碎片化，在小鼠肾细胞中导致DNA双链断裂，但渗透压诱导凋亡的机制需要进一步研究。在生物反应器中，由于pH控制通常是通过碳酸盐/碳酸氢盐缓冲剂实现的，这需要CO2，因此很难将盐分和CO2的影响分开。一项使用低盐培养基配方的研究表明，高渗条件与凋亡强烈相关，而CO2分压单独对Sp2/0细胞培养的活性没有显著影响。相比之下，pCO2对CHO细胞的生长有显著影响，而高渗压（尽管在310至376 mOSm/kg的非常窄的范围内）没有。氯化钠（NaCl）通常用于渗透压研究，并且已经证明了其对CHO细胞生长的剂量依赖性影响。有趣的是，脯氨酸补充已被成功用于抵消由NaCl添加引起的高渗压力的影响。这些结果令人惊讶，因为添加溶质进一步增加了培养基的渗透压，表明对NaCl或氨基酸诱导的渗透压增加有不同的反应机制。事实上，向小鼠肾细胞培养中补充尿素至最终渗透压600 mOsm/kg对DNA的损伤程度与添加NaCl至最终渗透压300 mOsm/kg相同，证实了溶质特异性效应的假设。这在生物加工中特别相关，因为人们一直在努力使用氯化钠提高细胞对渗透压应激的抵抗力；然而，这样的研究可能并没有针对与渗透压相关的问题的真正原因。最近，通过使用“渗透压空间”成功地从培养基配方中去除了氯化钠（和其他成分），以增加营养物质浓度而不使细胞受到高渗压力。在蛋白质生产方面，高渗性效应是产品特异性的，导致EPO-Fc滴度降低但单克隆抗体滴度不变。 与CHO细胞不同，当渗透压从290增加到450 mOsm/kg时，NS0细胞培养实现了延长的寿命，尽管细胞密度较低。只有在高渗培养（450 mOsm/kg）的最后几天才观察到滴度差异，这归因于它们改善的寿命。然而，在高渗条件下，特定单克隆抗体（mAb）的生产力和特定增长率更高。有趣的是，另一项研究表明，将补料分批NS0培养的渗透压从平均276增加到平均326 mOsm/kg显著改善了生长和单克隆抗体滴度，而进一步增加到381 mOsm/kg则有轻微的负面影响。这些结果表明，渗透压对细胞生长的影响取决于细胞系，可能还特定于克隆，并且对生产力和滴度的影响是产品特异性的。 3.2.7.错误折叠蛋白引起内质网应激 为了实现高滴度培养，需要过度表达蛋白质。然而，过度表达蛋白质可能触发内质网（ER）应激，导致凋亡和产品质量下降，因为由于内质网无法应对高蛋白质浓度，不完全的产品被分泌出去。表7显示了有关内质网应激对相关生物加工细胞系影响的文献综述。 未折叠蛋白反应被描述为内质网和细胞核之间的相互作用。错误折叠或未折叠蛋白的聚集激活了ER应激受体，即atf6（激活转录因子6）和需要肌醇的酶1（IRE1）。这些事件，连同atf4的激活，导致内质网和细胞核之间的相互作用，目的是重新建立ER的折叠能力，并通过合成蛋白酶和分子伴侣来减少正在处理的蛋白质数量。严重的ER应激导致一系列不同的事件，包括CHOP（C/EBP同源蛋白，一种促凋亡转录因子）的表达阻断和JNK（c-Jun N端激酶）对Bcl-2的磷酸化。这些结果导致Bim激活，进而激活Bax通道在ER和线粒体膜上形成。因此，钙，细胞色素C和其他凋亡激活剂被释放，最终触发半胱天冬酶激活和凋亡细胞死亡。另一个关键的相互作用是ER和线粒体之间的串扰。ER是钙离子的主要内部储存库，它们介导几种信号传导途径，ATP产生和凋亡。肌醇三磷酸受体类型1（IP3R-1），是钙信号传导机制的关键因素，被认为是半胱天冬酶-3的底物，Bcl-2或BcL-xL可能与ER表面不同类型的IP3R（1、2或3）相互作用，以控制钙离子释放速率，这种相互作用被Bax阻止。删除IP3R1基因导致对凋亡的抵抗。这些发现证实了钙在ER应激诱导的凋亡中的重要作用。 来自同一亲本CHO克隆的高和低单克隆抗体生产克隆中ER应激的动态表明，重链mRNA的上调与每个克隆的生产水平相关，并且分子伴侣的浓度将在培养结束时增加，此时达到最大单克隆抗体滴度。然而，低生产者比高生产者晚2天进入凋亡，而凋亡率保持不变。在IgG生产的CHO细胞中，过度表达未折叠蛋白反应基因成功地产生了一个生产力更高的克隆，尽管没有评估产品质量。同样，在NS0培养的下降阶段，ER蛋白表达的增加与单克隆抗体产量的增加相关。这些结果表明，未折叠蛋白反应（UPR）基因是增加单克隆抗体生产的好目标。然而，也有研究表明高单克隆抗体生产与分子伴侣表达增加有关，但X盒结合蛋白1（XBP1）的表达没有变化，XBP1是UPR的标志，这表明未折叠蛋白反应途径在GS-NS0细胞中活性并不更高，这些细胞具有更高的单克隆抗体生产率。作者建议这一观察可能是特定于克隆的。 识别对ER敏感的克隆和ER报告基因可以帮助选择高产者并在凋亡发生之前的所有工艺开发阶段监控压力。基于ER的选择策略已应用于CHO细胞，采用GRP78（ER应激报告基因）的表达作为高表达的标志；类似的策略已应用于NS0细胞，使用GADD153基因，其在几个NS0克隆中的表达被修改。GADD153被认为是ER应激开始的良好报告基因，其过度表达本身并不是凋亡的原因。总之，ER应激应考虑在内，特别是在细胞系开发和克隆选择的早期工艺开发阶段。 4.系统方法  传统上，生物工艺优化是通过顺序实验进行的，因此仅限于筛选设计空间的一小部分区域。最近，高通量策略和“组学”技术使评估范围更广的设计空间成为可能，尽管它们既耗时又成本高昂。凋亡工程和凋亡建模是合理的“系统”方法，可以促进细胞生物工艺的优化，因为它们可以筛选整个设计空间，有可能减少时间和成本。下面回顾了这些策略，可以单独使用或结合使用（图1）。 4.1.凋亡工程 凋亡工程是一种针对细胞系工程的方法，目标是通过合理的基因表达修改，发展抗凋亡细胞系。可以过度表达抗凋亡蛋白和/或下调促凋亡蛋白。这些研究的总结见表8。 最常用的抗凋亡基因是Bcl-2，它在各种环境压力下都能提供抗凋亡能力。在杂交瘤细胞中过度表达Bcl-2延长了几种培养条件下的寿命。在NS0细胞中，过度表达Bcl-2导致相互矛盾的观察结果：一些研究报告了对细胞密度和单克隆抗体生产的积极影响，而其他报告则没有显著影响。在CHO细胞培养中，过度表达Bcl-2导致细胞密度增加，寿命改善和凋亡减少，但没有影响单克隆抗体生产。过度表达Bcl-xL或Mcl-1提供了有希望的结果的替代策略。一项关于CHO细胞中过度表达Bcl-xL和Bcl-2的比较研究得出结论，Bcl-xL是CHO细胞工程比Bcl-2更有希望的目标，因为后者可能会损害蛋白质生产。事实上，通过在CHO细胞中过度表达Bcl-xL实现了2.7倍的灌注蛋白生产增加，而另一个过度表达Mcl-1的CHO克隆报告了单克隆抗体滴度增加了40%，没有显著影响产品质量。有人建议Bcl-2和Bcl-xL的效果可能是功能上冗余的，这种可能性也在Sp2/0细胞的研究中被指出，其中Bcl-xL的表达显著改善了培养寿命。 在CHO细胞中的其他凋亡工程方法包括过度表达Aven（凋亡体抑制剂）和E1b-19k（BH3-only蛋白抑制剂），这可以延长培养寿命。另一种方法是消除促凋亡蛋白。具体来说，在CHO细胞中消除Bax和Bak增加了培养寿命，并产生了更高的单克隆抗体滴度，同时使细胞对凋亡更加抵抗（即使化学诱导的凋亡），在33和37°C下均如此。有关这些策略的详细评论，包括抑制其他基因和使用半胱天冬酶抑制剂，可以在其他地方找到。最后，据我们所知，尚未实施的凋亡工程的一个不同方法是直接针对凋亡逆转机制，通过过度表达凋亡可逆性基因（XIAP、PARP、HSPs等），这可能导致阻止凋亡事件并启动Anastasis，将凋亡群体恢复为活性。 尽管针对凋亡的细胞工程取得了有希望的结果，但关于产品质量和副作用（如代谢变化和遗传稳定性）的信息仍然不足。蛋白质生产要么没有报告，要么显示出微小的改进，这归因于生物能量学的下调。两个例外是使用NS0细胞进行的恒化器研究，其中实现了单克隆抗体产量的3倍增加，以及在CHO细胞中过度表达Bcl-xL的研究，实现了单克隆抗体产量的2倍增加。由于细胞将能量利用集中在基本功能上，因此非基本功能的能量减少。这突出了阐明细胞能量学、其在凋亡中的作用以及遗传操作引起的任何代谢变化的重要性。例如，一个潜在的有趣替代策略是通过氨基酸和葡萄糖喂养来提供凋亡保护。尽管理想情况下是互补的，但营养喂养和凋亡工程可能是不兼容的。在过度表达Bcl-xL的Sp2/0细胞克隆中，谷氨酰胺喂养后活性保持不变，而野生型在喂养后活性得到改善。细胞的遗传操作也引起了对过度表达抗凋亡蛋白的细胞系稳定性的担忧，不仅因为这些细胞中观察到异常，而且因为这些蛋白的表达可能在长期或在可能影响产品质量的特定应激条件下丢失。过度表达抗凋亡基因（Fadd、Faim、Alg-2和Requiem）的遗传工程CHO细胞不仅显示出增加的活细胞数量和γ-干扰素产量，而且还增加了唾液酸化。 4.2.凋亡的数学建模 如图2所示，凋亡是一个高度调节的过程，其中几种蛋白质的干预确保细胞以受控且无害的方式死亡。由于其在生物加工中的显著影响，凋亡的数学模型将有助于整合生物过程数据，并预测生物反应器几何形状和操作对细胞死亡的影响。然而，凋亡的生物学复杂性使建模具有挑战性。表9总结了各种有限的凋亡建模尝试。 详细数学描述参与不同凋亡途径的所有蛋白质和相互作用在（1）捕捉生物学，（2）获取验证模型预测所需的实验数据，以及（3）产生计算可追踪的预测模型方面提出了重大挑战，这些模型可用于基于模型的过程优化。因此，凋亡建模有两种先验选择。在生物学方面，需要仔细基于证据的决策，确定要建模的干预措施和相互作用，而在建模方面则决定模型结构。虽然一些研究人员选择了基于链反应的公式（启动、放大和执行）或模拟细胞群体在状态之间的转换（存活、凋亡和死亡），但大多数人选择了动力学/机制公式，由于其动态特性通常更受青睐（Kyriakopoulos等人，2018b年）。模型复杂性归因于通过建模少数相互作用以捕捉详细的动力学关联，或者通过考虑整个途径但仅考虑少数干预措施来建模。描述少数物种详细模型的例子包括（1）DNA损伤模型，（2）通过各种途径激活半胱天冬酶-3的模型，（3）Bax/Bcl-2相互作用模型，（4）包括双稳态研究的半胱天冬酶3和8相互作用模型，后来又与实验数据进行了比较，以及（5）UPR模型或自噬和凋亡之间相互作用的模型。复杂网络模型包括Fas信号模型，其中某些模拟与实验数据进行了比较，以及描述使用敏感性分析和实验验证的最小凋亡诱导配体/受体比例的CD95诱导凋亡途径模型。Bentele及其同事的工作提供了一个适合生物过程社区兴趣的模型特征示例，特别是在与生物过程优化相关的方面。在CHO细胞中使用代谢通量分析（MFA）对葡萄糖、乳酸、五种氨基酸和氨进行了代谢和凋亡的整合；然而，代谢物预测超出指数生长期与实验数据不符，未能捕捉代谢转变。尽管MFA提供了有关细胞平衡代谢状态的有价值信息，但它在动态过程中的应用有限。使用结合建模/实验方法分析了营养应激对GS-NS0细胞基因表达的影响，其中简化的动力学模型捕获了营养和代谢物剖面，并描述了批量模式下六个凋亡相关基因（半胱天冬酶3和8、atf5、bcl-2、bax和trp53bp2（p53结合蛋白2））的表达。这项工作的主要缺点是在补料分批模式下缺乏预测能力。 如前所述，跨尺度的凋亡诱导应激在生物过程开发中很重要（图4），需要在凋亡建模中纳入空间效应。例如，虽然细胞总体上可能不会经历高剪切应力环境，但有些细胞会物理上靠近搅拌器。同样，尽管pH可能得到了很好的控制，但在酸/碱添加点的局部扰动可能诱导暴露于扰动的细胞凋亡。同样，尽管气泡破裂在整体上不构成问题，但在气液界面附近可能是有害的。计算流体动力学（CFD）建模考虑了空间效应，集成CFD-动力学模型将为最佳反应器几何设计（尺寸、体积、挡板数量和搅拌器位置）、最佳操作条件（通气、O2水平、搅拌等）以及最佳培养基设计和补料策略提供有关生产力和产品质量优化的有价值信息。 5.结论和未来方向  生物反应器中的细胞死亡主要作为凋亡的结果，活力的降低可能会影响产品滴度和产品质量。为了实现最佳操作，了解引起凋亡的应激在生物过程开发中至关重要。对于各种工业相关的哺乳动物细胞系，仍然缺乏对凋亡的原因和效应的全面阐明，具体到细胞系和克隆。此外，建立稳健和快速的凋亡表征方法以及开发新方法，包括细胞工程和in silico建模，以对抗凋亡，将进一步改善生物过程优化。总之，生物过程开发和优化必须考虑细胞系和克隆特异性属性，并超越喂养策略、培养基配方和细胞工程，进行全生物过程设计，以减少/消除凋亡原因。上游改进将对下游加工产生积极影响，具有累加的有益影响。