Kir2.1

基于机制的药物发现的关键要看对药物靶点的定义。随着试图将药物反应与遗传变异联系起来，理解分层的临床疗效和安全性，合理解释同一治疗类别中药物之间的差异，并预测药物在差异性患者中的效用，这一定义变得更加重要。然而，无论对于已上市的药物，还是对于发现和开发中的潜在治疗药物，文献中对药物靶点的定义往往很模糊。本综述呈现了一份详细的已批准药物分子靶点图谱。作者整理了总共893个人类和病原体来源的生物分子，1578种美国FDA批准的药物通过这些分子发挥作用。这些生物分子包括667种源自人类基因组的蛋白质，这些蛋白质是治疗人类疾病药物的靶点。对这些药物靶点的分析表明，优势靶点家族在各疾病领域持续占据主导地位，但也显示了新颖的首创（first-in-class）机制的增长，特别是在肿瘤学领域。作者探讨了生物活性类别与临床成功之间的关系，以及人类与动物模型之间、病原体与人类基因组之间直系同源物的存在情况。通过三个独立团队的合作，强调了在准确定义分子疗法靶点方面持续存在的一些挑战，并提出了阐明分子药理学和药物疗效复杂性的惯例。James Black 在2000年有句名言：“发现新药的最佳途径是从旧药开始”。在可行的情况下，对靶向药物作用机制的深入理解持续为药物发现、临床试验以及克服耐药性的努力提供信息。因此，维护一份准确且最新的已批准药物及其疗效靶点,即药物发挥治疗效果所通过的靶点（见专栏 1）的图谱是一项重要的工作，将指导未来的药物开发和创新。专栏 1 | 文章中使用的定义疗效靶点 (Efficacy target)在整篇论文中，使用术语“靶点”来指代药物直接结合并对其治疗效果负责的蛋白质或其他生物分子（如DNA、RNA、肝素和肽）。药物可能也与之结合或被其代谢，但未知对其治疗效果负责的生物分子，不被定义为靶点。尽管 ChEMBL 数据库为多链靶点（如蛋白质复合物）分配标识符，并注释药物结合的亚基（如果已知），但为了便于比较多个数据集之间的靶点注释，此处使用的数字反映了构成这些靶点的单个组分（在大多数情况下是蛋白质），蛋白质复合物的非配体结合亚基（在有足够结合位点注释的情况下）被排除在外。DrugCentral 使用相同的定义，但也要求与生物活性数据的链接。药物 (Drug)此处使用的“药物”定义仅指治疗成分，包括当前（或以前）被美国 FDA 批准（2015 年 6 月之前）用于增强人类健康的所有小分子和生物制剂，以及在世界其他地方批准的抗疟疾药物。术语“药物”不包括显影剂、营养补充剂、防晒霜或疫苗。此外，论文中报告的数字指的是去除药用盐后的母体化合物。识别全球任何地方批准的所有药物是一个极具挑战性的任务，因为涉及的监管机构众多，所需的信息来源多样。此外，信息缺乏也是一个挑战；例如，欧洲药品管理局没有 1995 年之前的批准数据，而日本药品和医疗器械局仅公布了自 2004 年以来的英文版批准药物清单（见“更多信息”）。然而，我们额外识别了一组由其他机构批准但目前未被FDA批准的 1200 多种药物，并在下文中单独讨论了这组药物中的新靶点。前药 (Prodrug)此处使用的“前药”定义指的是一种药物，其给药成分是无活性或仅具有轻微疗效的实体，但一旦进入体内，通过自发或酶催化反应转化为活性成分。据估计，大约 10% 的药物属于这一类。存在不同前药产生相同活性成分的例子（例如，氢化可的松被制成不同的前药，包括氢化可的松琥珀酸钠、戊酸氢化可的松和丙丁酸氢化可的松），也存在前药从单一给药成分产生多种活性成分的例子（例如硫唑嘌呤）。为简单起见，我们将疗效靶点信息分配给无活性的前药（母体），而不是活性成分，而后者才是实际与治疗靶点相互作用的分子。处方信息 (Prescribing information)处方信息是由销售已批准药物的公司提供的一份文件，其中包含关于该已批准药物的、以一致方式呈现的详细信息，包括临床药理学信息，如药物的作用模式。这些信息在 FDA 批准药物的药品说明书（drug label）中提供，可作为 PDF 或结构化产品标签（Structured Product Labelling）格式的标记文档获得。在欧盟，相应的文件是产品特性概要（Summary of Product Characteristics）。ATC 代码 (ATC code)解剖学治疗学化学分类系统代码（ATC 代码）由 WHO 药物统计方法合作中心（WHOCC）分配给药物。ATC 代码根据以下五个级别对药物进行分类：1 级，药物作用的器官或解剖系统；2 级，药理作用；3 级和 4 级，化学、药理和治疗亚组；以及 5 级，特定的单一药物或药物组合。例如，西地那非的 ATC 代码如下：1 级 (G)：泌尿生殖系统和性激素2 级 (G04)：泌尿科用药3 级 (G04B)：泌尿科用药4 级 (G04BE)：用于勃起功能障碍药物5 级 (G04BE03)：西地那非由于 ATC 分类的性质，一种药物可以有多个代码，特别是如果它作用于多个解剖系统；例如，阿司匹林有五个不同的 ATC 代码：B01AC06、A01AD05、N02BA01、N02BA51 和N02BA71。如果一种药物被用作单一产品联合疗法的组成部分，它也可以有多个代码。可以说，首次尝试编制一份确定的靶点清单可追溯到 1996 年，当时Drews 和 Ryser 估算了已批准小分子药物的人类分子靶点数量。从这篇文章及后续分析中，“优势”蛋白质家族的概念开始显现，这些家族在药物发现方面有着持续且成功的历史。2006 年，我们发表了一份药物靶点汇编，并确定当时可用的美国 FDA 批准的靶向药物通过 324 个机制性蛋白质靶点发挥作用。除了公认的可成药家族外，我们分析了优势家族，并额外识别出一个“长尾”，包含成员数量较少的、结构上不相关的多样化蛋白质家族，以及单个蛋白质。现在有几个数据库提供药物-靶点相互作用的数据，每个数据库都有不同的范围和侧重点。第一个是治疗靶点数据库（Therapeutic Targets Database）。DrugBank 是使用最广泛的专业药物信息资源，它将药物映射到据报道能与之结合的蛋白质上，而 SuperTarget是一个基于文本挖掘的直接和间接药物靶点汇编。最近，Rask-Andersen等人对当前药物的状况及其被认为是其在批准适应症中产生疗效的人类靶点，提供了更新的观点。此外，Munos 强调了过去十年中药物类别和靶点创新的趋势，而 Agarwal 等人分析了业界正在追求的药物靶点中的重叠性和独特性。最后，国际基础与临床药理学联合会和英国药理学会（IUPHAR/BPS）的药理学指南数据库（见“更多信息”）也汇编了已批准药物的信息，以及亲和力和选择性数据，并指定了有实验证据支持的主要靶点。Nature Medicine综述:AI药物研发最新进展然而，尽管有各种有价值的在线资源，要获得一份关于已批准药物（涵盖小分子和生物制剂）及其相关的分子疗效靶点（人类和病原体），并按治疗用途组织的、一致且全面的视图仍然是一个挑战。此外，尽管“靶点”的概念对于该领域的研究人员来说是很自然的，但在实践中，将这个靶点概念持续地映射到特定的基因和基因产物上存在相当大的操作困难。专栏 2 | 数据收集和分析方法疗效靶点分配和比较 基于 ChEMBL 21、DrugCentral 和 canSAR（见“更多信息”；DrugCentral 中的信息准确性已与包括 NCATS 药物合集在内的多个来源进行了基准比较的数据内容，编制了一份所有美国 FDA 批准的药物（小分子和生物制剂）以及在世界其他地方批准的抗疟疾药物的列表。该列表进一步分为小分子和生物制剂。在去除药用盐并合并药物列表后，获得了 1419 种独特的小分子药物和 250 种独特的生物制剂。对于每种药物，从当前版本的处方信息中提取疗效靶点，并在处方信息不可用或未报告作用机制的情况下，用科学文献进行补充。在分配疗效靶点时使用了以下指南：从处方信息的“作用机制”描述中识别靶点。如果可用，将治疗靶点分配给该化合物。如果处方信息中的信息含糊不清，则通过文献检索与该药物作用机制相关的出版物进行补充。对于有争议的情况，查阅关于疾病生物学或其他化学相关药物药理学的综述文章，并确定最可能的作用模式。当处方信息中描述的信息与多个亚基或亚型匹配时，通过查看其在疾病相关组织中的表达模式来评估哪个更可能是真正的治疗靶点。如果无法确定特定的亚基或亚型，则将所有可能的都指定为靶点。对于病原体靶点，如果处方信息列出了药物对其有效的多种微生物，则选择一个代表性的，而不是将所有微生物都指定为靶点。如果机制仍不清楚或未知，且文献未提供任何关于分子靶点的结论性信息，则不为该化合物分配任何靶点。所有外部数据集均于 2015 年 6 月检索，并且仅包括在此日期之前获得美国 FDA 批准的药物。数据集之间药物的映射基于每个数据集提供的药物名称和 ChEMBL 21 中的母体药物名称。为了改进映射，还考虑了与每个母体药物名称相关的同义词，以及前药情况下的活性药物名称。数据集之间靶点的映射纯粹基于 UniProt 登录号。。药物到 ATC 代码的映射 对于每种药物，从 ChEMBL21 或 DrugCentral中提取其相应的 WHO 解剖学治疗学化学分类系统代码（ATC 代码），并将其分配给其各自的给药成分（如果适用）或母体成分本身。对于 1669 种药物，有 1462 种可以映射到当前的 ATC 代码，其余 207 种被标记为“未分类”。靶点分类 蛋白质靶点分类是使用ChEMBL21 中现有的分类进行的。1 级和 2 级都被归属于每个人类和病原体疗效靶点。为简单起见，所有 1 级标记为“胞质其他”、“分泌型”、“结构型”和“表面抗原”的条目都重命名为“蛋白质其他”。疗效靶点、直系同源物和 ATC 代码映射 人类蛋白质疗效靶点的 UniProt ID 通过 Biomart 映射到 Ensembl 基因 ID 和 Ensembl 蛋白质 ID。从 Ensembl Compara 第 82 版提取了犬（Canis lupus familiaris）、猪（Sus scrofa）、大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠（Mus musculus）、斑马鱼（Danio rerio）、果蝇（Drosophila melanogaster）、线虫（Caenorhabditis elegans）和酵母（Saccharomyces cerevisiae）的直系同源物。人类（Homo sapiens）、恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）和大肠杆菌（Escherichia coli）之间的其余直系同源物从 InParanoid 第 8.0 版中提取，并通过 Ensembl 蛋白质 ID 进行映射。病原体蛋白质疗效靶点的 UniProt ID，由一组代表性的大肠杆菌蛋白质组成，用于从 InParanoid 第 8.0 版中提取人类、犬、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、线虫、酵母和恶性疟原虫的直系同源物。 每种药物被归类到一个 ATC 4 级类别中，对于每个类别，计算了这些药物的蛋白质疗效靶点的直系同源物。如果在某个 ATC 4 级类别内，并非所有蛋白质疗效靶点都有直系同源物，这将在图 5 的最终图中反映出来，通过对其存在进行着色，以反映在某个物种中具有直系同源物的疗效靶点的百分比。在此，我们综合并基于我们以前的方法，系统地重新编译和全面注释了当前的 FDA 批准药物列表（数据收集和分析的详细信息见专栏 2 和专栏 3）。我们为每种药物从处方信息和/或科学文献中指定其各自的疗效靶点或靶点集。我们强调，即使有了明确定义的疗效概念，在许多情况下，要做出清晰明确的指定仍然存在挑战，特别是在如何处理蛋白质复合物或与多个密切相关的基因产物结合的药物方面。AI+计算化学：从SMILES到3D结构转换的简单教程我们还将每种药物（以及由此产生的靶点）映射到 WHO 解剖学治疗学化学分类系统代码（ATC 代码），以此作为获得其标准治疗适应症的一种方式。ATC层级结构根据药物作用的器官或系统、治疗效果、药理作用和化学类别对药物进行一致分类。通过这种映射，我们探索了靶点类别在不同疾病领域的分布情况，并研究了优势靶点家族在投入了发现努力后的成功率。我们还编制了一份标准模式生物的药物靶点直系同源物列表，为更深入地理解物种差异、跨物种药物重定位以及动物模型系统的适用性奠定基础。专栏 3 | 数据分类和分析的附加细节临床成功(Clinical success)基于 ChEMBL20 的数据内容，编制了一份未批准化合物的列表。具体来说，从 ChEMBL20 中检索了所有最高研发阶段不同于 IV 期且已针对人类蛋白质进行过测试的化合物。在此背景下，蛋白质靶点被定义为靶点类型等于以下之一的靶点：“单一蛋白质”、“蛋白质复合物”、“蛋白质复合物组”或“蛋白质家族”。根据检测来源对化合物进行进一步筛选，仅保留其活性谱是从药物化学文献（检测来源等于1）中提取的化合物用于分析，并将其与蛋白质分类 2 级联系起来。去除药用盐后，未批准化合物的总数为382910。计算了与特定蛋白质靶点类别相关的独特化合物数量，并用于获得每个家族类别的测试化合物分布。其 2 级分类为空或未分类的蛋白质靶点被归为一个名为“其他”的单一靶点类别。此外，由于针对这些家族成员测试的化合物数量较少，以下家族也被分组并标记为“其他”：“离子通道TRP”、“离子通道KIR”、“离子通道SUR”、“离子通道RYR”、“离子通道ASIC”、“离子通道IP3”、“离子通道K2P”、“膜受体7tmfz”、“膜受体7tmtas2r”、“Toll样膜受体”、“连接酶”和“氨酰基转移酶”。 使用相同的程序来计算每个家族类别的已批准药物分布。简而言之，所有靶点为人类蛋白质的药物都与其蛋白质分类2 级相联系。去除药用盐后，药物总数为 1,194。计算了与特定蛋白质靶点类别相关的独特药物数量，并用于获得每个家族类别的成功药物分布。抗精神病药 (Antipsychotics)中枢神经系统药物列表是通过结合 WHO 解剖学治疗学化学分类系统代码（ATC 代码）和美国药典委员会（USP）系统的信息编制的。总之，具有 ATC 3 级代码等于“N05A”且被 USP 系统分类为抗精神病药或精神病用药的药物被认为是抗精神病药。pXC₅₀ 计算 平均效价（pXC₅₀：XC₅₀ 的负对数）值的计算方法如 Gleeson 等人所述，但略有改动。总之，从 ChEMBL 20 中提取了抗精神病药的生物活性数据，并进行筛选以仅包括来自靶点为人类蛋白质且标准化活性类型标记为 Ki,IC50₀,EC50, K50, XC50, AC50 或效价的检测的 XC50 值。在 ChEMBL 数据库中，已将以不同单位报告的活性数据标准化为纳摩尔单位，并将对数数据（如 pKi 和 pIC50）转换为非对数格式。这种标准化使得能够从数据库中提取最大可比的生物活性数据用于此分析。未标准化为纳摩尔单位或报告为“大于”或“小于”的 XC50值被排除。在少数情况下，原始出版物中的靶点信息未指定受体或蛋白质复合物的亚型或亚基。在这些情况下，数据被保留并独立分析，不与明确提及单个蛋白质的数据合并。提取数据后，对同一靶点和化合物记录的 XC50 值进行平均，并转换为 pXC50 值。图像软件 所有图形均使用以下程序的组合制作：R 2.15 、Circos 和Inkscape。定义疗效靶点的复杂性 定义机制性药物靶点集合需要明确的证据，证明药物通过清晰的生物分子伴侣发挥治疗作用。实际上，这种关联并非总是直接了当的。虽然在许多情况下可以注释一个被广泛接受且明确的靶点，但对于其他药物，通常存在分歧或理解随时间发生变化，这随后反映在原始来源之间的差异中。为了应对这一挑战，我们根据原始文献和处方信息重新分配了疗效靶点，并结合了欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所（EMBL-EBI）ChEMBL 数据库、新墨西哥大学 DrugCentral 数据库 和癌症研究所 canSAR 知识库的三个独立策展团队所做的注释。我们定义了一套简单、一致的指南来帮助我们分配治疗靶点（完整的指南见专栏 2）。总的来说，我们不仅仅依据现已广泛可用的生化和药理学数据来分配靶点。尽管可能有证据表明药物以中等甚至高亲和力与多个额外靶点结合，但除非有证据表明它们在药物的治疗效果中发挥作用，否则我们不认为这些是疗效靶点。Drug Discov Today｜小分子药物设计的进步：新方法和新见解例如，抗精神病药被认为主要通过作为多巴胺D2受体（由 DRD2 编码）的拮抗剂，有时作为 5-羟色胺（5-HT；也称为血清素）2A 受体（由HTR2A 编码）的拮抗剂或反向激动剂来发挥其作用。然而，抗精神病药也以纳摩尔亲和力与其他 5-HT 受体亚型以及肾上腺素能、毒蕈碱能和组胺能受体结合。然而，尽管有很多推测和研究，这些额外靶点对抗精神病药治疗效果的贡献尚未得到证实。例如，阿立哌唑，一种“多巴胺-血清素系统稳定剂”，其治疗效果被归因于其作为 D2和 5-HT1A受体的部分激动剂以及 5-HT2A受体的拮抗剂，尽管它也与其他蛋白质相互作用。然而，多巴胺稳定剂 (-)-OSU6162 似乎以中等（微摩尔）亲和力占据纹状体D2/D3受体的一个亚群，这表明例如D2受体占有率和组织特异性（纹状体核）之间的特定相互作用可能更具治疗相关性。因此，除 D2和 5-HT2A受体外的其他靶点尚未被注释为抗精神病药物的疗效靶点。一种药物对替代靶点具有高亲和力，或者同一类别的不同药物具有差异化的靶点结合谱，这对于开发下一代药物可能很重要。好用的虚拟筛选小分子库另一个挑战是如何为据报道具有广泛机制效应的药物分配靶点；这类药物的例子包括毒蕈碱受体拮抗剂、电压门控钾通道阻断剂和广谱 β-内酰胺类抗生素。对于这些药物，一种可能的解决方案是列出第一种情况下的 5 种毒蕈碱受体，第二种情况下可能形成电压门控钾通道的 4 种 α-亚基，以及第三种情况下，从药物有效的所有细菌物种中挑选出所有的青霉素结合蛋白（PBPs）。然而，在人类靶点的情况下，也可以根据选择性数据或表达数据选择一个更受限制的子集。对于病原体靶点，可以选择一个代表性的病原体物种，并且仅将该物种的生物分子或细胞组分指定为药物靶点。对于证据不足以确定哪些亚基或家族成员起关键作用的靶点，我们列出了所有可能的蛋白质。例如，所有用于治疗支气管痉挛的抗毒蕈碱药物都被分配了毒蕈碱乙酰胆碱受体 M₃（由 CHRM3 编码）作为其疗效靶点，因为这种毒蕈碱受体在气道中的表达水平最高，并负责支气管收缩。然而，有证据表明 M₁和 M₂受体不能被明确排除；例如，M₁受体负责人类的支气管收缩，而组织表达数据似乎表明 M₂受体可能同样参与其中。对于广谱抗菌药物，大肠杆菌被选为 ChEMBL 中的代表性物种。因此，所有广谱 β-内酰胺类抗生素都与来自大肠杆菌的七种 PBP 相关联，尽管很明显并非所有 PBP 都是所有 β-内酰胺类药物在所有物种中的靶点。然而，在 DrugCentral 中，易感病原体物种是根据报告为针对明确定义的病原体的最低抑菌浓度的抗菌数据来指定为靶点的。例如，非那沙星（finafloxacin）一种被批准用于治疗由铜绿假单胞菌和/或金黄色葡萄球菌引起的耳炎的氟喹诺酮类药物，被注释为同时靶向这两种物种。ACS Med Chem Lett｜现代药物研发中的计算应用和工具汇总有了最低抑菌浓度和物种数据，微生物学家可以比较抗生素的效价和易感性，这两者都是抗生素疗效的重要方面。这种策略与 ChEMBL 注释分子靶点的方法是互补的；例如，所有氟喹诺酮类药物都被注释为大肠杆菌DNA 促旋酶抑制剂。DrugCentral 的方法侧重于微生物而不是细菌蛋白质靶点，因为没有明确证据表明该抗菌药物在其他物种中也有效。此外，细菌具有局部特异性，即有些偏好结肠（例如大肠杆菌），而有些则偏好鼻咽窦腔、肺、肾或皮肤。抗生素针对不同的感染有不同的处方。这种差异使得靶点分配更加复杂，因为特定的抗生素可能通过主动转运进入某个组织（感染所在处），而其他抗生素则可能不会。此外，感染会导致组织反应不同。例如，细菌性脑膜炎使血脑屏障通透性增加，从而能够使用那些通常不穿过该屏障但在这种感染中有效的抗生素。这种与病理相关的现象在分子水平上更难解释。Nat Rev Drug Discov｜21世纪FDA批准癌症疗法的趋势肿瘤学是一个进一步说明定义疗效靶点挑战的治疗领域。分配给 ATC 类别 L01（抗肿瘤药）和 L02（内分泌治疗）的 FDA 批准药物可大致分为三组。第一组是靶向人类 DNA 和/或 RNA 的细胞毒性药物，例如铂类化合物。第二组是至少部分通过蛋白质靶点起作用的细胞毒性药物，例如 DNA 聚合酶、DNA 拓扑异构酶和蛋白酶体抑制剂。最后，第三组中的药物通常被认为是靶向治疗药物，例如激酶抑制剂。然而，将药物归入第三组而非第二组因观察到的靶向谱而变得复杂。例如，拓扑异构酶抑制剂对其靶点具有选择性，但毒性很高。相反，一些激酶抑制剂抑制广泛的正常功能的激酶及其相关通路，并且在临床上已报道了对这些药物的不良反应。分配癌症药物疗效靶点的另一个挑战是激酶抑制剂数量的迅速增长（截至 2016 年 6 月，全球已批准 37种小分子蛋白激酶抑制剂）。最初的临床假设可能基于特定基因（例如，表皮生长因子受体（EGFR））的改变，但最终上市的药物可能抑制广泛的激酶靶点，其中大多数在失调通路之外起作用——尽管激酶信号通路在癌症中很大程度上是相互连接的。例如，凡德他尼（vandetanib），被批准用于治疗转移性甲状腺髓样癌，抑制致癌基因 RET 的激酶产物，该基因在许多甲状腺髓样癌患者中发生突变。凡德他尼还抑制其他具有相互连接通路的激酶，例如 EGFR 和血管内皮生长因子受体（VEGFR）通路。激酶铰链区结合骨架和氢键形成特征事实上，处方信息通常在描述药物作用机制的部分列出大量靶点，而关于单个靶点重要性的确定性通常只有在药物与伴随诊断测试（见“更多信息”）一同获批时才能获得。然而，与上述 D₂受体拮抗剂的情况相反，处方信息中列出的与药物结合的激酶通常作用于相互关联的通路；因此，我们有机制上的理由怀疑它们参与了药物的疗效。因此，我们试图将所有可能对观察到的药物疗效有贡献的蛋白质都纳入我们的药物靶点列表，并且这个列表会随着我们对药物作用理解的提高而改变。使用这些指南，最终的分配仍然需要大量的策展工作。例如，对于 2009 年批准的抗心律失常药物决奈达隆（dronedarone），FDA 标签指出它具有属于所有四个Vaughan-Williams 分类的抗心律失常特性，并且其作用机制是“未知的”。这一陈述意味着在分子水平上，它可能具有调节钠通道（I 类）、β-肾上腺素能受体（II 类）、电压门控钾通道（III 类）和 L 型钙通道（IV 类）的能力。最近，通过 HCN（超极化激活的环核苷酸门控）通道（有四种亚型，HCN4 是在窦房结中表达最丰富的形式）阻断 If 电流（起搏电流）被认为是决奈达隆产生心动过缓效应的主要机制，而不是调节 L 型钙通道或 β-肾上腺素能受体。值得注意的是，最近批准的心脏药物伊伐布雷定（ivabradine）也通过 HCN 通道阻断 If 电流。然而，决奈达隆的研究并未排除钠通道或电压门控钾通道在药物整体疗效中的作用，而是纯粹关注其心动过缓效应。其他研究进一步表明，抑制内向整流钾通道（特别是 Kir2.1）可能有助于决奈达隆的抗纤颤疗效。最近的一篇综述 明确指出，决奈达隆具有多种抗心律失常作用，并且作用机制复杂，可能或多或少地涉及许多不同的靶点类别。蛋白质数据库大全这种复杂性反映在其他数据库中对该药物注释的多样性上。例如，Rask-Andersen 等人为决奈达隆指定了一个电压门控钾通道（KV11.1；由 KCNH2 编码）和两个肾上腺素能受体作为靶点，而治疗靶点数据库仅列出KV1.5（另一种电压门控钾通道）作为靶点。DrugBank 共列出了决奈达隆的 18 种蛋白质（肾上腺素能受体、钠和钾通道以及 L 型钙通道），但都标记为“药理作用未知”，因为对其策展人而言，它们的治疗作用不确定。最后，IUPHAR/BPS 药理学指南数据库不包含决奈达隆的任何主要靶点信息（或结合亲和力数据），尽管它确实描述了其机制涉及肾上腺素能受体以及钠、钾和钙通道。截至 2016 年 1 月，这些资源中没有一个将 HCN 通道注释为决奈达隆的靶点，尽管这一特定信息已在几年前发表，并且至少有一篇专门针对决奈达隆的后续综述 同意 HCN 通道阻断可能是一个重要的作用机制。决奈达隆的复杂案例凸显了我们的注释只是代表当前知识的一个快照。随着更多实验的进行和对药物机制认识的增加，我们将继续在ChEMBL、DrugCentral和canSAR数据库中策展和更新我们的分配。这种复杂性也是网络药理学概念的核心——即药物作用通常需要几个同时存在的不同干预点。在实践中，究竟有多大比例的药物绝对需要结合多个靶点才能发挥疗效，还有待观察。表 1 | FDA 批准药物的分子靶点药物靶点类别总靶点数小分子药物靶点数生物制剂药物靶点数总药物数小分子药物数生物制剂药物数人类蛋白质6675491461,194999195病原体蛋白质18918472202155其他人类生物分子28922986335其他病原体生物分子97479718该列表还包括在世界其他地方批准的抗疟疾药物。药物、靶点和治疗领域 将来自ChEMBL、DrugCentral和canSAR 数据库的靶点注释相结合，提供了一套统一的药物疗效靶点。通过这种方法，我们确定了667个独特的人类蛋白质疗效靶点和 189 个病原体蛋白质疗效靶点（表 1）。使用 ChEMBL 的层级靶点分类系统，我们接着检查了人类蛋白质靶点如何分布到同源家族中，并确定了最富集的家族。视紫红质样 G 蛋白偶联受体（GPCRs；也称为7TM1）、离子通道、蛋白激酶和核激素受体被认为是优势家族，因为它们单独就占了所有人类蛋白质靶点的 44%（GPCRs：12%；离子通道：19%；激酶：10%；核受体：3%）。此外，由于每个靶点的已批准药物数量不同，这些优势家族负责了 70% 的小分子药物的治疗效果（GPCRs：33%；离子通道：18%；激酶：3%；核受体：16%）。图 1 | 主要蛋白质家族作为药物靶点。 a | 按基因家族划分的人类药物靶点分布（左）和按靶向这些家族的药物比例划分的分布（右）；四个家族的历史主导地位显而易见。b | 优势蛋白质家族类别的临床成功。 ChEMBL 20 中未批准化合物（从药物化学文献中提取，具有针对人类蛋白质靶点的生物活性测试）按家族类别的分布，以及已批准药物（小分子和生物制剂）按人类蛋白质家族类别的分布。7TM：七次跨膜家族；GPCR：G 蛋白偶联受体；LGIC：配体门控离子通道；NTPase：核苷三磷酸酶；VGIC：电压门控离子通道。蛋白激酶的药物和靶点比例之间存在巨大差异，这是因为小分子激酶抑制剂典型的广泛多重药理作用，而核受体则情况相反。定向蛋白激酶抑制剂领域在我们最初的 2006 年出版物 中被强调为一个新兴的靶点类别，这一趋势显然仍在继续。其余的人类蛋白质疗效靶点大多是不相关的酶。对于生物制剂而言，分泌型或表面抗原蛋白是最重要的靶点类别。考虑到高分子量药物在体内的分布受到高度限制，这一结果符合预期。在我们的分析中，每个靶点的药物数量和每个药物的靶点数量值得注意。通过简单平均，我们得到每个靶点对应两种药物的数字。然而，这个结果是对复杂药理学的过度简化。一些靶点为选择性药物提供了丰富的土壤，例如糖皮质激素受体（有 61 种已批准药物），而另一些则属于相反的类别，例如激酶抑制剂，其中少数药物作用于许多靶点，从而对这些药物的整体药理反应做出贡献。另一个关键的发展趋势是单克隆抗体疗法，它们通常对单一基因产物具有高度特异性。这与小分子药物形成对比，后者与多个靶点相互作用（多重药理作用）更为常见。激酶抑制剂提供了一些最著名的多重药理作用例子，因为它们的生物活性在药物发现和开发过程中通常会针对许多激酶（以及其他靶点）进行分析。高通量（体外）检测技术的引入使得这种分析成为可能。然而，对于大多数在 1990 年之前批准的药物，这种类型的靶点分析并非系统性的；因此，我们理解靶点家族内部和外部多重药理作用的能力是近年来的努力。从片段到先导化合物的成功案例成功“成药”的蛋白质家族的高度偏向性分布也反映在检查 ChEMBL 数据库中靶点类别水平的生物活性数据分布偏向上（图 1b）。ChEMBL 是一个开放获取的大规模生物活性数据库，包含从药物化学文献中手动提取的信息以及来自美国采用名称（USAN）申请的数据。因此，ChEMBL 提供了一个对药物发现的先导化合物优化阶段小分子化合物的无偏见反映。数据的基于蛋白质家族的组织方式使得能够在靶点家族水平上详细检查临床开发过程中的损耗（具体来说，可以识别出有效的先导化合物，但这些化合物随后可能在临床开发中失败）。按家族汇集数据可以进行更稳健的统计分析，并减少特定靶点对分析的影响。如图 1b 所示，很明显，在视紫红质样 GPCRs 上的发现阶段投入，至少到目前为止，一直持续获得回报，因为已批准药物的比例略高于 ChEMBL 中靶向该家族成员的化合物比例。在核受体、电压门控离子通道（VGICs）、各种还原酶、电化学转运蛋白和配体门控离子通道（LGICs）中也发现了同样的相对富集（或在临床开发中的存活率）。Nature评论｜AlphaFold被认为是药物发现的下一件大事，事实果真如此吗有趣的是，就核受体而言，近年来没有出现属于该家族的新疗效靶点，尽管有些目前正在试验中。对于蛋白激酶和蛋白酶，投资回报则呈现相反的趋势。然而，对蛋白激酶作为药物靶点的兴趣是最近才出现的，许多潜在的激酶导向药物仍在积极的临床开发中。对于已被广泛探索且损耗率高的家族——例如，胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶——这些数据支持了该家族平均而言固有成药性较低的可能性。这个简单的数据驱动分析中的其他例子指向了某些情况下特定靶点的损耗；例如，超过 40 种丝裂原活化蛋白激酶 p38α（也称为 MAPK14）抑制剂已进入临床试验，但通常仅进展到或停滞在 II 期试验。表 2 | FDA 批准药物的治疗领域ATC 类别治疗领域小分子药物数量生物制剂药物数量A消化道及代谢系统15832B血液及造血器官3328C心血管系统2005D皮肤科用药1415G泌尿生殖系统945H激素系统4431J全身用抗感染药19410L抗肿瘤及免疫调节剂14267M肌肉骨骼系统626N神经系统2391P抗寄生虫产品、杀虫剂和驱避剂381R呼吸系统1184S感觉器官14311V各种3012U未分类15651该列表还包括在世界其他地方批准的抗疟疾药物。ATC，WHO 解剖学治疗学化学分类系统。为了深入了解按疾病领域的药物创新模式，我们将靶点与其对应的药物联系起来，然后将药物与其 ATC 代码联系起来。每个治疗领域的小分子和生物制剂药物数量见表 2。然后，我们根据其全球或 FDA 批准年份将药物按 ATC 3 级代码分组。如图 2 所示，靶向心血管系统（C 类）或皮肤病系统（D 类）的药物的成熟度是显而易见的。相比之下，图 2 也说明了肿瘤学和免疫学领域（L 类）的近期创新，以及抗寄生虫药类（P 类）近期进展缺乏和可用药物数量少的情况。在靶点家族水平上进行的类似分析显示，与通过核受体或离子通道起作用的近期批准药物数量相比，近期批准的调节激酶的药物数量更多（图 3）。具体来说，自 2011 年以来，已有 20 种蛋白激酶抑制剂获得 FDA 批准，占所有激酶调节药物的 28%。如果在分析中仅考虑小分子药物，这个比例会更高，因为生物制剂，如胰岛素衍生物（主要在 1990 年前批准），构成了激酶调节药物的相当一部分（尽管这些生物制剂不与通常用于定义家族成员资格的蛋白激酶催化域结合）。图 2 | 治疗领域的创新模式。内圈中的每个节点对应一种由其 WHO 解剖学治疗学化学分类系统代码（ATC 代码）或代码代表的药物。内圈对应于 ATC 代码的 1 级（表 2），并根据该类别中的药物数量进行缩放。外圈代表 ATC 代码的 3 级。随后的每个直方图都说明了按 ATC 代码 3 级首次批准年份分布的药物（小分子和生物制剂）数量。最大直方图刻度：100。批准年份指的是首次已知的全球批准日期，如果不可用，则为首次美国 FDA 批准日期。最后，为了研究药物、靶点类别和治疗领域之间的关系，我们再次将靶点与其对应的药物联系起来，并将药物与其 ATC 代码联系起来，然后连接那些共享属于同一靶点类别的疗效靶点的药物。通过这种方式，我们可以分析跨疾病或解剖系统的靶点家族或功能类别的混杂性（图 4）。例如，如果我们观察几个先前确定的优势靶点家族——属于视紫红质样 GPCRs、VGICs、LGICs 和蛋白激酶的膜受体——我们看到视紫红质样 GPCRs 几乎是所有 ATC 类别中小分子药物的靶点（图 4a），除了抗寄生虫产品（P 类）和激素系统（H 类）。相比之下，蛋白激酶占分配给小分子的人类蛋白质疗效靶点的 13%，但仅占小分子药物的 2.4%，几乎所有这些都是抗肿瘤和免疫调节剂（L 类）。在连接分配给生物制剂药物的激酶时，也体现了这一类别，但对于这类药物，激酶似乎在其他解剖系统中也起着重要作用。对于整体生物制剂而言，只覆盖了一小部分的 ATC 类别（图 4b）。如图 4a 所示，离子通道产生的模式也很独特。VGICs 和 LGICs 都覆盖了肌肉骨骼系统（M 类）、神经系统（N 类）、消化道和代谢系统（A 类）、呼吸系统（R 类）和心血管系统（C 类）。VGIC 家族还覆盖了皮肤病系统（D 类）和感觉系统（S 类）。推测这种聚类反映了身体各种信号和控制子系统根深蒂固的进化关系，并可能为有效的药物重定位和副作用责任提供额外的指导和约束。图 3 | 优势蛋白质类别的创新模式。条形图描绘了调节四个优势家族的药物（小分子和生物制剂）数量，按首次批准年份分布。每个条形图顶部的粗体字体显示了已批准药物的总数，以及自 2011 年以来批准的药物数量和占调节这四个家族药物总数的百分比。“离子通道”包括电压门控和配体门控离子通道。没有 ATC 代码（未分类 (U)）的药物被排除在此分析之外。图 4 | 优势蛋白质家族类别的混杂性。 外圈中的每个节点对应一种由其 WHO 解剖学治疗学化学分类系统代码（ATC 代码）或代码代表的药物。外圈对应于 ATC代码的1级，并根据该类别中的药物数量进行缩放。内圈代表ATC代码的2级。当两种药物具有属于同一靶点类别的疗效靶点时，一个节点连接到另一个节点。全球药物批准情况 尽管上述分析仅限于 FDA 批准的药物和在世界其他地区批准的抗疟疾药物，但我们也整理了另外约 1200 种来自 WHO 国际非专利名称（INN）列表（见“更多信息”）并结合文献检索 筛选出的、由其他监管机构批准的药物的作用机制数据。这些药物中的绝大多数属于相同的化学类别，并与 FDA 批准的药物共享相同的靶点。例如，选择性环氧合酶 2（COX2）抑制剂依托考昔（etoricoxib）已在 80 多个国家获得批准，但由于安全问题目前尚未获得 FDA 批准，而血管紧张素 II 受体拮抗剂非马沙坦（fimasartan）仅在韩国获得批准。纳入这些药物后，确定了八个额外的新型药物疗效靶点（表 3）。表 3 | 非 FDA 批准药物独有的药物疗效靶点靶点名称UniProt 登录号示例药物ATC 类别适应症醛糖还原酶P15121托瑞司他A10XA糖尿病并发症黑素细胞刺激素受体Q01726阿法诺肽D02BB红细胞生成性原卟啉病P2Y 嘌呤受体 2P41231地夸磷索NA干眼症Rho 相关蛋白激酶 1Q13464利帕舒地尔NA青光眼Rho 相关蛋白激酶 2O75116利帕舒地尔NA青光眼转甲状腺素蛋白P02766他法米迪斯N07XX淀粉样变性肌钙蛋白 C，慢骨骼肌和心肌P63316左西孟旦C01CX充血性心力衰竭胸苷磷酸化酶P19971替匹拉西NA结直肠癌*替匹拉西是用于治疗结直肠癌的辅助剂，以增强曲氟尿苷的作用。ATC，WHO 解剖学治疗学化学分类系统；NA，不适用。动物模型中的直系同源物 选择最佳模式生物来研究特定疾病或验证新的靶点机制，涉及在模式生物中诱导一种与人类病理学有足够相似性的疾病状态，以便能够根据模式生物中的效应可靠地预测在人类中的效应。实际上，这并非易事。一种可用于选择合适模式生物的方法是，利用核心的人类“药物靶基因组”（pharmacolo me，我们在此定义为当前药物调节的基因产物集合）来编制典型模式生物中的直系同源物列表。然后，这些基因可以映射回各自的蛋白质疗效靶点，疗效靶点映射到药物，药物映射到治疗适应症。因此，从这些数据中，可以推断出哪些治疗领域可能最好地被哪些模式生物所模拟。图 5 是将这些信息可视化在一个图中的结果。与图 4 类似，外圈对应于按这些类别中已批准药物数量缩放的 ATC 类别。内圈由 ATC 4 级类别组成，指示化学、治疗和药理学亚组。然后显示了一系列按物种排列的热图，根据该 ATC 4 级类别中有多少蛋白质疗效靶点在模式生物之间是保守的进行着色。人类或大肠杆菌热图中的深蓝色部分表示药物靶点是人类蛋白质或细菌蛋白质。疗效靶点的保守性始终是相对于药物靶点物种而言的。总体而言，脊椎动物（狗、猪、大鼠、小鼠和斑马鱼）都对人类药物靶点集合提供了相对较好的覆盖。然而，在某些情况下，表观的变异是由于基因组注释和/或对于较新完成的基因组的直系同源物分配目前不完整造成的。正如预期的那样，果蝇和秀丽隐杆线虫的基因组包含较少的人类疾病靶点的直系同源物。这些差异反映了与人类相比显著不同或缺失的解剖系统。然而，保守程度在两个物种之间以及不同治疗领域之间差异显著。例如，秀丽隐杆线虫保留了许多负责皮肤病和泌尿生殖系统药物疗效的靶点，而这些靶点似乎在果蝇中缺失。当考虑更简单的单细胞生物如酵母或大肠杆菌时，通常只剩下反映核心必需细胞功能的靶点，例如 DNA、蛋白质和核苷酸合成。在寻求识别新的抗感染靶点时，通常提出相应蛋白质在宿主生物（通常是人类）中缺失是成功的重要先决条件，并且这种约束通常应用于潜在靶点的生物信息学筛选中。然而，从图 5 可以看出，尽管几个病原体靶点确实缺乏人类直系同源物，但也有一些蛋白质同样存在于人类或其他哺乳动物中。如果考虑核糖体，具有人类直系同源物的病原体靶点数量会进一步增加。例如，二氢叶酸还原酶（DHFR）抑制剂在人类中被用作抗菌剂、抗肿瘤剂和抗寄生虫剂。靶向 DHFR 的抗菌剂，如甲氧苄啶，通常在人类系统上实现足够的选择性和治疗指数，以避免基于机制的毒性。图 5 | 蛋白质疗效靶点在几种模式生物中的可用性。外圈中的每个节点对应一种由其 WHO 解剖学治疗学化学分类系统代码（ATC 代码）或代码（见“更多信息”）代表的药物。外圈对应于 ATC 代码的 1 级（表 2），并根据该类别中的药物数量进行缩放。下一个环代表 ATC 代码的 4 级。随后的每个环代表一个不同的物种，如图例所示，环的每个部分根据该 ATC 4 级类别中药物疗效靶点的直系同源物存在与否进行着色。深蓝色部分表示蛋白质疗效靶点的物种。图的底部显示了图表的扩展部分。 图例说明：深蓝色：药物靶点76–99% 的靶点有直系同源物51–75% 的靶点有直系同源物26-50% 的靶点有直系同源物1–25% 的靶点有直系同源物无直系同源物或蛋白质靶点物种列表（从内到外）：人类、犬、猪、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、线虫、酵母、大肠杆菌、恶性疟原虫癌症驱动基因与癌症靶点 过去十年中，药物发现的相当一部分努力涉及合理选择要靶向的机制性癌症驱动基因。此外，癌症是大型系统性识别疾病驱动基因努力增长最快的领域，这得益于主要的国际联盟，因此，考虑这些努力对识别经临床验证的新靶点的影响是很有趣的。FDA 批准的 154 种癌症药物可大致分为上述三组：26 种是细胞毒性药物；38 种药物是广谱细胞毒性的，并且至少部分通过蛋白质靶点起作用，例如蛋白酶体抑制剂；85种药物可以分配给明确的机制性蛋白质靶点。另外 5 种药物通过未知或非蛋白质靶点起作用。基于“组学”数据系统性识别癌症驱动基因的努力极大地促进了近年来第三类药物数量的增长。这种方法的影响通过 2002 年发现 BRAF 是恶性黑色瘤的主要驱动基因得到清晰说明，这导致 2011 年批准 BRAF 抑制剂维罗非尼（vemurafenib）作为黑色瘤的首个靶向疗法。随后，靶向与维罗非尼相同信号通路的MEK 抑制剂曲美替尼（trametinib）于 2013 年获批。另一个例子是在非小细胞肺癌中发现 EML4–ALK 驱动易位，导致 ALK 抑制剂克唑替尼（crizotinib）于 2011 年获批。药物机制与真正的癌症驱动基因之间的关系值得考虑。我们先前分析了识别癌症驱动基因的趋势，并表明多项研究正趋向于在不同癌症中发现约 600 个癌症驱动基因。我们将 553 个癌症驱动基因的共识列表与上述 85 种蛋白质靶向癌症药物的 109 个蛋白质靶点列表进行了比较（图6），发现两组之间存在少量重叠（30 个蛋白质）。药物发现之靶标与受体这种小重叠有几个原因。尽管这些研究涉及大量患者，但它们在组成和用于选择驱动基因的统计方法上可能存在偏见；因此，一个基因可能未能达到最终的统计流行率阈值。另一个原因是，许多这些驱动基因是新发现的癌症相关基因，历史上对其进行的生物学研究很少；因此，时间会证明它们是否能为药物发现提供有用的靶点。事实上，我们自己的分析表明，至少 10% 的癌症驱动基因可能可以通过小分子药物成药，但此类研究尚未在药物化学文献中报道。最后，也是重要的一点，非癌基因成瘾（non-oncogene addiction）过去是——并且将继续是——可以被治疗性靶向的癌症的一个关键方面。FDA 批准的激素识别和激素生物合成靶向药物，如用于乳腺癌的芳香化酶抑制剂、用于前列腺癌的细胞色素 P450 家族 17 亚家族 A 成员 1（CYP17A1）抑制剂，以及用于卵巢癌的聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抑制剂，都例证了这一趋势。正在进行临床研究的利用合成致死性对抗癌基因的药物包括用于 DNA 损伤修复缺陷型前列腺癌的 PARP 抑制剂。其他药物正在利用非癌基因成瘾；例如，VLX-1570 抑制蛋白酶体 19S 相关蛋白泛素特异性肽酶 14（USP14），以利用多发性骨髓瘤中的 19S 成瘾。此外，许多癌症基因是功能丧失型驱动基因；在这种情况下，基因已被删除或通过基因组畸变而失活，靶向这些基因通常需要合成致死的方法。因此，系统性绘制疾病驱动基因图谱可以通过识别潜在靶点和突显可以被药物作用的关键通路来指导未来的治疗策略。图 6 | 癌症药物靶点与癌症驱动基因的重叠。将美国 FDA 批准的癌症药物分为三类：广谱细胞毒性药物，如铂类复合物和 DNA 嵌入剂；通过蛋白质起作用的细胞毒性药物，如对癌细胞没有生物学选择性的微管蛋白抑制剂；以及通过明确的蛋白质功能调节机制起作用的靶向药物，如激酶抑制剂和核激素受体拮抗剂。当将第三组药物的靶点与癌症驱动基因的共识参考列表进行比较时，观察到癌症驱动基因与当前癌症药物靶点之间只有少量重叠。(图示：154 种癌症药物 ->123 种通过蛋白质靶点调节 -> 85 种靶向药物；109个癌症靶点与 553 个癌症基因产物/驱动基因重叠 30 个)结论性思考与未来工作 在本文中，我们对当前已批准药物及其靶点的多样性提供了一个增强和更新的视角，重点关注过去 10 年的变化和趋势。编制一份准确且一致的药物疗效靶点列表并非易事，通过三个团队的努力，我们朝着这个目标取得了重大进展，同时也突出了实践中存在的一些挑战。这些挑战包括解决基因与药物靶点之间非平凡的关系，分配靶点，以及最终建立一个惯例来处理复合物、亚基、剪接变体和蛋白质亚型，以便在计数最终有效分子靶点时使用——这是蛋白质靶点数量从我们先前研究中确定的 324 个增加到 667 个的一个主要因素。所有这些都是分析现有药物和靶点多样性并结合其疾病覆盖范围的前提。然而，由于关于药物作用机制的知识在文献中不断变化，这些注释将需要频繁更新。因此，该数据集将被维护并公开访问。合并后的药物疗效靶点数据的一个子集（称为 Tclin）目前可在“照亮可成药基因组”。JMC综述| 靶向激酶门卫突变的药物研发有趣的是，在我们先前列举药物靶点的文章发表后的 10 年里，优势家族如视紫红质样 GPCRs、核受体和 VGICs 在很大程度上保持了它们在药物靶点空间的主导地位，这突显了具有可成药结合位点的蛋白质家族的持续效用。过去十年的主要变化在于蛋白激酶和蛋白酶靶点的比例；这些靶点以前加起来占总靶点集的不到 2%，现在分别占所有已批准药物靶点的 6%（蛋白激酶）和 4%（蛋白酶）。令人欣慰的是，来自几个代表性不足家族的单一示例靶点的长尾持续增长，表明我们在药物发现方面的创新能力。推测表型筛选与靶向筛选对发现首创药物的相对贡献是很有趣的。最简单的观点是，需要多重药理作用才能发挥作用的小分子药物，如舒尼替尼（sunitinib），更可能通过表型筛选而非靶向筛选被发现。然而，数据可能表明情况相反。由于表型筛选通常针对机制性和药效学生物标志物的调节进行优化，因此以这种方式发现的药物更倾向于具有更特异的药理学特性。相比之下，通过基于靶点的筛选发现小分子药物，优化了药物对所需靶点的活性，以及对少数已识别脱靶靶点的选择性，而没有充分研究该药物更广泛的细胞活性。Nature: 药物虚拟筛选——少即是多随着组织表达数据和将分子事件映射到临床事件的因果模型的不断涌现，药物疗效靶点与疾病组织定位之间的关系将逐渐被考虑在内，因为药物作用更可能在所选组织中发挥。例如，尽管抗帕金森病药物罗匹尼罗（ropinirole）对 D3 受体的效力比 D2 受体高一个数量级，但我们仍将 D2 受体注释为作用机制靶点，因为 D2 受体（而非 D3 受体）在黑质中表达，而黑质是抗帕金森病药物的病理相关组织。未来的疗效靶点注释预计将广泛利用靶点和疾病的明确组织共定位数据。随着我们对复杂疾病原因的理解加深，我们发现这类疾病涉及环境因素、遗传和表观遗传功能障碍的组合。因此，靶向治疗的还原论方法在未来是否仍有一席之地？无论最初的原因是什么，大多数人类疾病都是由蛋白质的异常作用引发或介导的。因此，需要一个机制上复杂且经过充分实验注释的药物库来应对这种复杂性，包括整合药物组合、网络药物和多重药理学。这些方法在癌症和传染病中尤为重要，因为在标准治疗药物的选择性压力下，异质性和进化导致了耐药性的出现。RET新一代抑制剂耐药机制分析医疗有两个目标：正确诊断疾病和选择合适的治疗方法。只要在适当条件下观察到（药物引起的）表型改变，就有可能指导医疗并调整治疗管理以获得更好的结果。因此，成功药物发现和应用的关键在于将疾病的病理机制（即分子和细胞水平过程）、诊断（疾病在器官和/或生物体水平的临床体现）和治疗（即通过治疗药物在分子水平上调节临床表现）无缝整合。药物发现和靶向仍然是一个复杂、昂贵且时而不可预测的过程。然而，结合正在涌现的对疾病和基础生物学的新见解，我们希望本文报道的关于当前成功药物、其疗效靶点、表型效应和疾病适应症之间关联的知识，能够有助于有效发现新一代药物。参考文献:Santos R, Ursu O, Gaulton A, et al. A comprehensive map of molecular drug targets[J]. Nature reviews Drug discovery, 2017, 16(1): 19-34.

同写意20周年大会：中国医药创新未来之路！“意”同创新，穿越周期，赢取未来。7月中旬，苏州金鸡湖畔，让我们与“新药写意人”一起为中国医药创新“同写意”！ 安全药理学研究药物和生物制品对核心生理器官功能造成不良药效学影响的可能性。重点是研究这些产品类型（在非临床开发过程中可能以治疗浓度或高于治疗浓度给药）的药理学如何影响三个重要器官系统的功能--心血管（Cardiovascular CV）系统、呼吸系统和中枢神经系统（Central Nervous System，CNS）。对这三个重要器官系统的研究共同构成了安全药理学核心课程。次级器官系统包括胃肠道系统、肾脏系统、泌尿系统和自主神经系统以及其他系统等，在必要时也可进行评估。 不良药效学效应可能是由于受试产品的靶向一级药效学效应，可能与给药剂量、给药途径和频率以及全身暴露量有关，也可能是由于称为二级药效学的脱靶效应。安全药理学核心组合（core battery）包括的三个主要重要器官系统在生理上相互关联，这意味着在一个系统中出现的效应可能会在其他系统中引起适应性反应。因此，解读安全性药理学数据通常需要对器官功能的整体影响进行综合风险评估，并考虑目标临床人群、临床试验计划和安全系数。本章将讨论安全性药理学研究的时间安排，这与预期的患者人群相一致。 安全药理学已成为一门学科，在对新产品进行首次人体试验之前，通过开展核心组合研究来预测不良药效学风险。安全药理学研究有助于从效益风险较低的药品中筛选出安全性较高的药品，此类药品或很少或没有潜在的心血管、呼吸或中枢神经系统影响，或具有足够的安全系数。值得注意的是，如果在临床试验中出现不良反应，或者如果已上市产品被重新用于新的适应症、患者人群，或者以新的制剂或途径给药，而在此之前不需要进行安全药理学评估，那么处于开发后期的产品也可能需要进行安全药理学评估。 本章提供的信息主要基于美国食品药品管理局（FDA）、欧洲药品管理局 （EMA）和人用药品委员会（CHMP）的文件，这些文件讨论了国际人用药品技术要求协调理事会（ICH）关于人用药品安全药理学研究的安全 （S）指南7A。ICH S7A指导方针规定，所有人用药品（小分子、生物技术衍生药物或生物制品）在首次人体临床试验期间的用药安全性应达到合理水平。 因此，根据良好实验室规范（GLP）进行的安全性药理学研究的评估，在治疗范围及以上，人体首次用药预计不会对重要器官的生理功能产生任何不良的药效学影响。安全药理学研究的时间安排与FDA和EMA/CHMP就 ICH M3（R2）关于开展人体临床试验和药品上市许可的非临床安全性研究的指导意见相一致。目前，细胞和基因治疗产品或组织工程产品在安全药理学指南中没有专门论述。 本章还将讨论最近批准并实施的ICH E14/S7B Q&A指南，该指南概述了如何接受体外hERG（人类ether-a-go-go相关基因，human ether-a-go-go related gene）和体内QT间期研究数据（即：非临床、双阴性），均根据Q&A最佳实践建议进行，以支持两种临床场景（E14 Q&A 5.1和6.1），以申请豁免全面QT（TQT）研究。本章末尾提供了案例研究，以展示如何在实践中开展安全药理学研究。 1 安全药理学试验的一般原则和重要性 安全药理学指南于2000年首次制定，以应对抗组胺药物特非那定对心血管系统影响的不良报告。特非那定于1985年由Hoechst-Marion Roussel公司（现赛诺菲-安万特公司）引入市场，在美国以Seldane、英国以 Triludan和澳大利亚以 Teldane 等名称销售，用于治疗过敏性鼻炎。后来发现特非那定是钾离子通道（IKr 或 hERG）的强效抑制剂，会导致QT间期延长。这有可能发展为多形性室性心动过速，即Torsades de Pointes（TdP），字面意思是心电图等电位线周围的点或峰（R 波或 QRS 波群）扭曲。 在临床试验之前，特非那定的心脏毒性潜能尚未被发现，因为这种药物完全由肝酶细胞色素P450 3A4（CYP3A4）代谢，因此在血浆中的浓度未被检测到。此外，其代谢物特非那定羧酸盐（也称作非索非那定）对钾离子通道没有抑制作用，即使其浓度比特非那定的hERG IC50高30倍。然而，当患者患有影响 CYP3A4酶的肝病或正在服用抑制CYP3A410的其他药物时，原药特非那定的促心律失常潜能就会在高剂量下显现出来，因为这会导致代谢降低，从而使特非那定的血浆浓度升高，而非索非那定的浓度降低。 非索非那定的疗效与特非那定相似，但由于它只对hERG通道有轻微抑制作用，因此诱发心律失常的可能性要低得多。1996年，非索非那定以Allegra13的名称上市，用于治疗过敏性鼻炎和慢性荨麻疹等疾病，并被列入世界卫生组织的基本药物清单，而特非那定则因可能导致心律失常而于1997年退出市场。 因此，小分子或生物制品对所有三个核心器官系统(心血管、呼吸、中枢神经系统)的潜在不良影响必须在进行首次人体研究之前进行。虽然ICH S7A提供了核心组合研究的指导和收集的功能终点，但它没有概述研究设计本身。下一节将讨论体外和体内研究的安全药理学研究设计，并提供示例，可以根据评估中的药物或生物药物的药理学（或化合物类别）、途径和剂量、适应症和预期患者群体准确地应用或修改。 2 核心组合研究设计和终点 在测试新产品的安全药理学时，首先需要测试三个核心器官系统的潜在不良药效学效应：心血管系统、呼吸系统和中枢神经系统（CV system, the respiratory system, and the CNS）。 3 心血管系统 评估对心血管系统影响的研究类型包括： ▪ 体外研究（如心脏离子通道研究） ▪ 体外研究（如 Langendorff 技术） ▪ 体内研究（如啮齿和非啮齿动物模型遥测技术） 4 体外心血管研究 体外心血管检测大多涉及心脏离子通道的研究，法规要求进行hERG检测（Table 5-1）。其中一种检测方法是自动hERG检测，用于确定药物抑制 hERG 钾通道的潜力。在药物开发的早期阶段，使用单一浓度的供试品，这种检测法可作为筛选工具，在结构-活性关系研究过程中和确定先导化合物之前，识别出具有潜在hERG倾向的化合物。对发现(有倾向)的hERG试验进行后续跟进，使用剂量递增的供试品浓度来估算其IC50，即抑制生物效应50%所需的药物浓度。然后再按照GLP规定进行严格的手动膜片钳hERG试验。 最近发布的S7B Q&A要求跟进体外hERG试验。然后在过表达人心肌离子通道（S7B Q&A 2.1）的人类胚胎细胞或中国仓鼠卵巢细胞上进行实验因素的最佳实践，其中包括钾、钙和钠通道。ICH指南中有关实验因素的最佳实践问答要点包括： ▪ 在接近生理温度（35-37°C）下进行手动膜片钳实验； ▪ 测量心室动作电位电压方案； ▪ 监测过表达心脏通道细胞的健康状况； ▪ 记录密封电阻质量；以及 ▪ 报告 IC50 值和希尔系数 此外，经过验证的分析方法应支持浓度验证，并应将多非地利、昂丹司琼和莫西沙星这三种阳性对照品中的一种作为参照药物进行评估。关于后者，应进行重复评估，每次实验应使用两种或两种以上浓度的供试品，每种浓度至少包括四个细胞。 在考虑了血浆蛋白结合和使用血浆中的游离药物浓度后，计算出的IC50抑 制浓度的安全系数应大于预期临床暴露浓度的50倍。本章稍后提到的 "体外原发性心律失常综合分析"（CiPA）计划建议并纳入了对其他心脏离子通道的评估。 在评估肿瘤产品时，由于肿瘤产品的收益风险比可能高于其他药品，因此可以在不遵守GLP法规的情况下进行hERG和心脏离子通道抑制测定。对于生物制品或生物技术产品，靶点特异性通常很高（target specificity is usually very high），因此不需要但建议（not required but are recommended）进行体外 hERG 检测。在评估这些生物制品时，可将体内心血管终点整合到使用非侵入性遥测技术进行的重复给药毒理实验中（Table 5-2）。 5 体外朗根多夫技术 朗根多夫技术是一种体外试验，即用含氧缓冲克雷布斯溶液灌注动物离体心脏，在其中加入或不加入待测药物。其目的是观察药物对心电图参数、心率、左心室力学和冠状动脉血流估计值的影响。通常使用豚鼠或兔子心脏，因为它们的心脏具有IKr钾离子通道，而这是人类心室复极化（即心电图的QT间期）的主要心脏离子通道。研究表明，使用体外检测法，QT延长药物对人体的影响是一致的。将离体灌注豚鼠（啮齿动物）心脏测定法转化为大型动物QTc测定法，用于测定已知可延长QTc的药物和 13种已知对QTc间期无影响的药物的QTc变化。 实施该技术时，先移除动物的心脏，然后以逆行方式通过主动脉导入灌注液；这样就能通过冠状动脉输送含有载体或药物的富氧、营养灌注液。记录的终点包括从放置在心外膜表面的导联II配置电极上记录的心电图参数、心率、左心室收缩参数（如心室压力的最大上升率和最大下降率）以及平均冠脉流量。 通过检查心肌、平滑肌和冠状动脉血管内皮，可以检测试验药物对心肌功能（电活动和收缩活动）和冠状动脉血管的影响。尽管朗根多夫技术有一些局限性（如无法评估代谢物、分离超过4至6小时的心脏功能活力等），但它既可作为心血管疾病筛查试验提供快速信息，也可在需要对早期发现试验的结果（如心脏受体的受体结合试验或hERG结果）进行进一步检查时提供快速信息，因为该试验可生成心电图，用于评估间期（如：RR、PR、QRS、QRS）、 RR、PR、QRS、QT和计算出的QTc间期、心律和左心室压力曲线。 6 体内心血管研究 体内心血管研究包括通过手术植入遥测装置对自由活动（非啮齿类动物，如犬、非人灵长类或小型猪）动物的心血管系统进行评估。此类装置有多种生物电位和压力导管配置，也有用于测量呼吸功能的阻抗导线可供选择。有多种遥测装置可供选择，既可用于短期研究，也可用于长期研究，还可在多项研究中重复使用（有足够的洗脱期），通常以发射器的电池寿命为基础。植入式遥测使用血管内放置的实心心电图电极，具有高分辨率或低信噪比。这样就可以在采集后的分析过程中准确地在心电图间隔上放置信托标记。 其他选择包括非侵入性外套式体外遥测（JET），该方法将表面电极与小型植入式遥测装置配对，用于收集动脉血压（符合ICH S7A CV 研究要求），其中电气元件固定在外套口袋。Table 5-2列出了这些研究中收集的CV终点。使用内置仪器对动物进行遥测研究非常方便，因为动物可以自由移动，而且一旦手术植入并恢复，只要之前的测试材料已从动物体内清除，且研究之间有足够的洗脱期，动物就可以在多项CV试验中重复使用。 当植入的遥测设备同时记录ICH安全指南7A中规定的心血管和呼吸参数时，研究被称为心肺研究。独立的心血管或心肺功能研究通常在非啮齿类动物中进行，采用4 x 4拉丁方交叉设计，即在洗脱期（通常为3-7天）后，以随机方式给每只动物以对照品和低、中、高剂量的三个剂量水平的试验药物。该设计的统计效力优于平行或递增剂量设计，因为每只动物都是自己的对照组，而且每次试验都包括所有剂量水平，从而减轻了序列效应（表5-3）。这种设计使用的动物数量最少（总共四只），符合动物使用的3R原则--替代（replace）、优化（refine）、减少（reduce）--并可根据分组饲养选择或提高统计能力而进行修改。 半衰期较长的供试品(如寡核苷酸、单克隆抗体和生物制剂)洗脱期超过7天时，可采用平行研究设计。该设计由四组（每组4 - 6只）动物组成，可纳入独立遥测研究(安全药理学环境)，或者将CV安全药理评估整合到平行的重复给药毒理实验中（毒理学环境）。只有在暴露量没有性别差异的情况下，才可以使用雄性;否则，需同时使用雄性和雌性。恢复组通常只有对照组和高剂量组，因此使用4只动物，在低剂量组和中剂量组中没有恢复期动物。 考虑因素包括植入式遥测术的手术安排和植入成本。在某些情况下，基于总体方案考虑，逐步升级的研究设计也可以适用于动物依次接受载体对照、低、中、高剂量选择（表5-4）。安全药理学评估供试品的急性效应，因此建议在单次给药后第1天收集CV参数，如果将其整合到重复给药毒理实验中。如果供试品的动力学允许，当第1天的所有活动完成后，可以在第2天收集CV参数，因为第1天给药和所有其他活动（如毒代动力学采血、临床病理学和临床观察）会对CV参数造成不利影响。 心血管研究测量动脉血压（收缩压、舒张压和平均动脉压）、心率（次/分）、第二导联心电图参数（心电图间期和节律）和体温。定性心电图分析包括波形形态（P 波、QRS 波和 T 波）和任何心律失常的描述，定量测量包括心电图间期持续时间（RR、PR、QRS和QT）。应使用单独的心率校正方法对QT间期进行心率校正（QTc）。 CV遥测技术的优势在于，它通过收集每次心跳的数据来生成一个强大的数据集，而且从用药前至少1小时到用药后22小时都会对动脉血压进行连续监测。收集逐次心跳的CV数据可捕捉药效学效应（如果存在），包括起效、Cmax和恢复期。收集到的逐次心跳数据可分为1分钟数据，用于数据处理。可测量每次正常心跳的定量心电图间期（PR、QRS和QT），心率可表示为两个连续RR间期之间的间隔或每次血压脉冲的计数。心电图遥测研究按照GLP法规进行。 可在独立的心血管安全药理学研究中增加一个可选的毒代动力学阶段，在心血管阶段洗脱后在相同的动物中进行，采用重复拉丁方形设计，以剂量递增（低、中、高）的方式进行，并在两次剂量之间进行洗脱，或在心血管阶段洗脱后对所有四只动物一次给药（低、中、高）。毒代动力学研究也可在单独的一组动物中进行，在这种情况下，应进行单次毒代动力学数据收集，作为CV研究的一部分，用于确认浓度，但不用于Cmax，以避免在CV遥测数据收集期间干扰动物。也可考虑在CV监测期间增加一次毒代动力学数据采集。如果要收集数据，应计划在Tmax之后进行，以便将CV监测过程中的暴露量与完整的暴露概况联系起来。 7 呼吸系统评估 核心呼吸系统研究将呼吸频率、潮气量和每分钟呼吸量作为主要研究终点进行评估，因为它们不仅能捕捉到对肺力学的直接影响，还能捕捉到可能来自中枢神经系统呼吸中枢的间接呼吸影响（Table 5-2）。当确定或怀疑存在呼吸系统倾向时，可评估的其他终点包括氧饱和度和气管支气管树的气流（阻力、气流、气流持续时间）、肺运动和充盈的难易程度（顺应性、弹性）以及肺泡气体扩散。 大多数呼吸系统研究包括评估药物对通气模式的影响，有时还包括血氧饱和度。当预计会对呼吸系统产生直接影响时，可考虑采用核心组合以外的先进监测方法，如胸膜压力-容积环路，以量化支气管收缩可能导致的气道阻力变化。 啮齿类动物（大鼠比小鼠更常用）最常用于呼吸安全药理学研究。这些研究使用胸透法测量气道中的容积变化。在啮齿类动物中可考虑使用几种胸透仪配置，包括全身型、头外型和仅鼻型。所有这些配置都可用于测量呼吸频率和潮气量，但全身胸透的优点是不需要束缚动物。胸透法需要一个适应期，要么适应全身腔室，要么适应束缚期，通常在给药后4个小时才能收集数据。大多数小分子药物的典型研究设计是在独立的呼吸研究中进行一次给药，采用平行设计，分四组，每组至少八只动物，分别给予低、中或高剂量的供试品或对照品（Table 5-5）。为减少动物用量，啮齿动物呼吸试验也可采用拉丁方交叉设计。 这些研究中的基线数据应在首次给药前收集，给药后数据应在给药后4小时内立即收集。如果评估供试品的药代动力学需要更长的时间，则可使用全身胸透法收集啮齿动物用药后24小时内的额外时间点数据。 啮齿类动物的呼吸系统研究也可整合到重复给药毒理试验中，即指定研究动物的一个小组，并在给药第一周的指定一天（即第3天）用于测量呼吸系统终点（Table 5-6）。动物可以是单性别的，每组8只雌性动物，以避免超过胸透室的容纳量（中枢神经系统用6只雄性动物）；如果由于暴露量的性别差异则雌雄动物都需包括在内，则每种性别5只动物。 对于急性给药效应，在第1天进行安全药理学评估；如果对长效药物或生物制品进行评估，则在第1周和给药的最后一周进行安全药理学评估。不对恢复期动物进行评估。与独立的呼吸安全药理学研究类似，重复给药毒理试验中呼吸评估将在试验动物适当适应后使用胸透法，收集给药前至给药后4小时的数据。在非啮齿类动物研究中，主试验动物将使用配备呼吸电感胸透（JET-RIP）波段的非侵入性外套式体外遥测装置进行评估，或在动物体内通过外科手术植入心肺遥测装置。在重复给药毒理试验中，可选择在给药结束时和恢复期结束时收集数据。 在啮齿动物呼吸安全药理学研究中，提高灵敏度的关键因素是剂量。按升序（从对照组到高剂量组）和降序（从高剂量组到对照组）给每组一半的动物加药，这样所有的动物组都能暴露在给药室的技术人员面前，并有时间在胸透室中从加药期间的应激反应中恢复过来。 如心血管研究所示，对于持续时间较长的评估，建议在大动物（即非人灵长类和犬，小型猪较少）中进行心肺联合研究。研究期间测量的参数包括呼吸频率（呼吸频率）、潮气量、分钟量（呼吸频率与潮气量的乘积，也是总通气量的测量值）、吸气峰值流量、呼气峰值流量、增强暂停以及吸气和呼气时间。后续研究已经建立，并可根据需要对气道阻力、顺应性、肺动脉压、血气、血液 pH 值等进行评估。 8 中枢神经系统评估 药物对中枢神经系统的影响通常采用功能观察组合（Functional Observation Battery，FOB）或改良 Irwin 评估进行测量。中枢神经系统核心安全药理学试验可使用与毒理试验一致的啮齿动物物种单独进行，或将啮齿动物中枢神经系统安全药理学研究整合到重复给药毒理试验中（表5-5和5-6）。FOB和Irwin是符合ICH S7A要求的首选检测方法，但这些检测方法的主要问题在于其主观性和定性性，这一点与行为测试一样。如果有迹象或观察到对中枢神经系统的不良影响（如癫痫发作），则可能需要进行定量中枢神经系统安全性药理学后续研究，在这种情况下，可能需要进行脑电图（EEG）检查。 FOB和Irwin观察评估旨在评价运动活动、行为变化、协调性、感觉运动活动、感觉运动反射反应和体温。大多数小分子供试品的典型研究方法是单次给药、平行分组设计、独立的中枢神经系统研究，每组至少有六只大鼠（单一性别；如果没有暴露量性别差异，则为雄性），分低、中、高剂量给对照组或试验组。动物采用群居饲养，根据剂量组的分配情况，每个笼子最多可饲养三只动物。训练有素的中枢神经系统技术人员在进行FOB或改进的Irwin评估时，通常会对治疗方法设置盲区。数据应在给药前一天（即预处理）或给药当天（基线）收集。用药时间要错开，以便同一技术人员有时间在用药后的选定时间点进行FOB或改进的 Irwin 评估。 FOB评估与改进后的欧文评估之间的差异在于观察期间如何处理动物的细微差别。FOB通常会在Cmax前后和用药后24小时内进行评估，而改进后的Irwin可能会在Cmax前后和用药后5小时内进行多达五次观察，如果在用药后5小时仍检测到影响，则会在24小时内进行观察。 FOB和Irwin评估也可纳入重复给药毒理试验，以评估剂量范围、持续时间、行为可逆性和生理功能。根据目标人群的不同，研究中可使用不同年龄（新生儿、幼年、成年）或怀孕状态的啮齿类动物，每组六只主要动物（单一性别）或每种性别五只主要动物。如果将这些评估作为重复给药毒理试验的一部分来进行，通常会将雄性啮齿动物分配到中枢神经系统研究中，而将雌性啮齿动物分配到呼吸系统研究中（Table 5-6）。 同样，在对动物进行随机分组之前，首先要让动物适应实验室；这通常是毒理试验方案的一部分。在毒理试验的某一天安排进行FOB或Irwin评估，并在指定的基线时间点给动物注射对照物质和三个剂量水平的供试品，然后将动物放回笼子里；然后在选定的时间点观察动物，直至用药后24小时。在评估过程中，可交错给药，以便一名观察者在每个时间点收集和记录多个动物和处理组的所有参数。目的是确定动物可耐受且未观察到不良影响的最高剂量，以及确定对动物行为造成明显不良影响的最低剂量。 在Irwin评估中，包括几项观察： • 群养笼边观察，包括姿势、异常行为（如抽搐、颤抖、发声、刺激和刻板行为）；操作观察，如移出的难易程度、操作反应、体温、流涎、流泪或皮脂分泌； • 在开阔地带的运动活动，包括自发运动活动、步态异常、刻板行为、易激惹、排尿或叛逃；以及 • 自主神经活动评估，如触觉反应、惊吓反应、向右/睑/抓握反射、捏尾、热痛觉、共济失调、体温和瞳孔反应。 • 此外，还会记录临床症状和体重。 在进行FOB评估时可发现的症状包括： • 共济失调 • 反应性 • 催眠（对外界刺激缺乏反应）； • 被动（缺乏反应或不挣扎）； • 自发的运动活动（运动、饲养、梳理）； • 社会互动； • 刻板行为（重复、无目的的行为，如摇头、摇晃、啃咬、舔食）； • 死亡率； • 眼球突出（目测眼球突出）； • 步态（肌张力低下或肌张力亢进--肌肉无力导致的姿势歪斜）； • 抓握反射（通过有线操作测量抓握能力）； 握力 • Straub 尾部反应（尾部从水平线上抬起）； • 震颤（对立肌群交替收缩引起的不自主运动）； • 抽搐（自主肌肉剧烈的不自主收缩，可以是肌肉交替收缩和放松的阵挛性收缩，也可以是持续收缩的强直性收缩、痉挛样收缩或阵挛性和强直性混合收缩）； • 腹泻 • 流泪； • 瘙痒（毛发蓬乱）； • 上睑下垂（由于上眼睑下垂、瞳孔缩小而导致部分或全部闭眼）； • 直肠温度 • 流涎 • 排尿； • 角膜反射（眨眼反应）； • 直立反射（身体恢复正常直立姿势的能力）； • 松果体反射（缩回或抽动耳朵的反应）； • 夹尾巴；以及 • 热板反应 在ICH S7A中，通过FOB或Irwin评估筛选和监测候选新药对中枢神经系统的潜在不良影响，是评估中枢神经系统安全或人体安全风险的第一步，尽管这些测试取决于进行观察的人员的技能。可能需要综合各种终点来检测潜在的不良事件，而不仅仅是单个参数。有些终点不能直接转化为人体中枢神经系统不良事件，因此无法确定完全一致。 如果在FOB或Irwin试验、重复给药毒理试验或临床试验中发现了对中枢神经系统的不良影响，则可能需要进行后续研究（如认知和学习、恐惧和焦虑等）以及使用脑电图（EEG）进行癫痫发作责任评估，以进一步阐明中枢神经系统不良影响的性质和作用机制，然后再继续药物开发。在啮齿类动物中观察到的异常现象（如摇头、抓挠、过度梳理和舔食）往往发生在惊厥之前，可能是阵挛性或强直性的。 9 生物制品或生物技术衍生药品的安全药理学 ICH S6（R1）涵盖了生物制药（即生物制品或生物技术衍生药品）的安全药理学测试。 生物制品以其选择性（如抗体结合或受体配体）著称，预计不会影响CV或呼吸系统或中枢神经系统。然而，它们可能具有靶标放大药理学效应，或潜在的脱靶次生药理学活性，可能对构成安全药理学的重要器官产生不利影响。对于大多数生物制药（大分子或生物技术衍生产品）而言，根据ICH S6（R1），安全药理学终点被纳入重复给药毒理试验中。但是，如果生物制药对受体结合的选择性不高，代表一种新型或一流产品，或两者兼而有之，则可能需要进行独立或后续研究，以进行更广泛的安全药理学评估（即根据ICH S7A）。 对于在啮齿动物中具有活性的生物制品，中枢神经系统不良反应的安全药理学终点（即使用 FOB 或改进的Irwin评估）在单次给药或重复给药后进行评估；这取决于供试品的给药途径、给药方案。如果生物制品对非人灵长类动物和啮齿类动物都有活性，则可在啮齿类动物和非人灵长类动物中评估不良反应，但如果只对后者有活性，则只在非人灵长类动物重复给药试验中纳入安全性药理学终点。 在某些情况下，体外中枢神经系统安全性研究是在进行体内研究之前进行的，以指导选择安全药理学终点，并酌情纳入重复给药试验和随访研究（即根据ICH S6(R1)指南）。 10 肿瘤产品安全药理学 肿瘤产品的安全药理学已纳入ICH S9。对于专为晚期癌症设计的肿瘤产品，有必要加快候选药物的临床开发，以便患者能够及时获得这些药物。根据ICH S9，虽然无需进行独立的（即ICH S7A规定的）安全药理学研究，但可将对三个重要器官系统（心血管、呼吸和中枢神经系统）的不良影响评估纳入重复给药毒理试验中，或仅限于评估从大动物（如犬、非人灵长类或迷你猪）毒理学研究中收集的心电图（有科学依据）。 评估安全药理学核心组合中三个重要器官系统的重复给药毒理试验应按照GLP 法规进行，并进行详细的临床观察。在啮齿动物（通常是大鼠）中，重复给药毒理试验通常包括FOB或Irwin评估，28天毒理试验中一半的主试验动物（如10只雄性动物中的5只）在第1天接受评估，以及详细的呼吸系统观察（如10只雌性动物中的5只），给药组与对照组进行比较。 在非啮齿动物重复给药毒理试验中，除详细观察外，还要收集心电图和血液动力学测量数据（心率、血压和体温）；这些数据在基线（即给药前）、第1天（给药第一天）和给药最后一周（即第28天或第90天）收集，如果有必要，还包括在研究中期收集。给药组的测量结果将与对照组结果进行定量比较，并评估显著变化，将其与剂量水平、毒代动力学暴露量或两者相关联。如果在给药最后一周的评估中发现影响，一般会在恢复期增加CV、呼吸和中枢神经系统评估，以评估可逆性。 由于潜在的收益风险比更大，人们希望加快肿瘤产品的开发，监管部门不要求进行单独的安全药理学研究。由于安全药理学评估被整合到重复给药毒理试验中，因此患者安全问题可以得到充分解决，同时也符合ICH S9规定的动物使用3Rs要求。 在设计肿瘤产品的后续安全药理学研究时，需要考虑药理学和临床适应症，并根据具体情况进行此类研究（Table 5-7）。根据ICH S645和ICH S946，这些研究应予以精简，以减少动物数量，尤其是生物制品和肿瘤药物，而且还应根据具体情况对这些重要器官和其他器官进行补充试验（Figure 5-1）。 11 体外原发性心律失常综合测定 体外原发性心律失常综合分析法（CiPA）由FDA于2013年开发，旨在改进原发性心律失常标志物的评估，并提供更相关、可靠和全面的临床前体外心脏筛选工具。这一举措是基于某些药物（如维拉帕米）有可能阻断hERG通道，但在人体中不会导致心律失常。 顾名思义，CiPA包括对参与心室动作电位的心肌离子通道的全面评估，因此它的使用支持了对hERG评估的要求。CiPA的第一步是对转染hERG的细胞进行六种心脏离子通道的膜片钳检测：hERG、Nav1.5（晚期钠）、Cav1.2（钙）、KvLQT1（慢延迟整流钾电流；IKs）、Kir2.1（负责膜电位的内向整流钾通道；IK1）和Kv4.3（快速瞬时外向钾电流；Ito）。 这些膜片钳测定的数据随后被用于提供人体心室动作电位的计算机模拟模型，从而提供有关早期心脏潜在损伤的信息。驱动计算机模型的算法可以预测心室动作电位的变化（如延长）以及任何早期后极化的产生。早期后极化是导致心律失常风险的早期诱因。硅学模型，如O'Hara Rudy模型，是健康人心室动作电位的精确模型，能够评估延长QT间期的化合物，而这些化合物与前心律失常风险无关（如维拉帕米）。最后，通过硅学建模获得的膜片钳数据将被评估是否可转化为诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（iPSc-CM）。 CiPA还包括使用人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（hiPSC-CM）。利用多电极阵列技术对这些细胞进行评估，测量化合物的细胞外场电位，帮助确定对心血管电生理学有潜在不利影响的化合物。记录到的场电位波形的变化是心室动作电位变化的基础，可能表明hERG或其他离子通道（如钠通道Nav1.5，负责动作电位的上冲，或钙通道Cav1.2，负责动作电位的持续时间）受阻。 因此，场电位持续时间的延长可能导致心室动作电位的延长，并可能显示心电图上记录的QT间期的延长。药物引起的动作电位延长应与细胞间搏动的可变性引起的动作电位延长区分开来，并使用阳性和阴性对照化合物。如上所述，在CiPA期间还研究了除hERG之外的其他钾通道，如Kir2.1、Kv4.3、KCNQ1/KvLQT1_mink。 12 其他器官的安全药理学 根据治疗适应症和毒性研究中的不良反应结果，还可对核心组合以外的器官系统进行安全药理学研究。这包括肾脏或泌尿系统、胃肠道系统和自主神经系统等。此类研究的终点将取决于所测试的系统，但可能包括排尿量和电解质排泄量、胃肠道转运时间和胃排空、免疫细胞表型等免疫学参数、激素水平等内分泌参数以及正压性低血压。这些参数可用于评估这些其他器官系统的功能变化。 所有候选药物或生物制品都应在非临床药物开发期间或临床开发II期之前，根据具体情况，采用适合目的的研究设计，对这些其他器官系统进行必要的安全药理学测试。 • ICH E14/S7B Q&As - 临床 TQT 研究对非临床研究的需求 ICH E14指南和ICH S7B问答涵盖了临床TQT研究对非临床研究的需求。ICH S7B于2005年实施，旨在指导开展非临床安全药理学研究，评估新药在首次人体试验前延长心室复极化（QT间期）的可能性。同年，ICH E14获得通过，概述了开展临床研究的必要性，以评估这些新药对延迟心脏复极化潜能的影响。 FDA公布了2016年至2020年进行的TQT研究数量数据，发现32%的研究未能达到E14 Q&A 5.1的两倍高临床暴露阈值。此外，另有24%的临床研究采用了替代研究设计（其中 82% 用于肿瘤适应症），由于无法进行TQT研究，导致标注为  “QTc 影响较小"。为了减少临床TQT研究的数量，E14/S7B Q&As指导原则于2022年2月获得批准，2022年7月定稿，并于 2022 年8月实施。非临床双阴性结果（即 hERG和体内QT/QTc研究结果均为阴性），并结合临床E14 Q&A 5.1（当临床暴露量未达到2倍临床高水平时，支持TQT豁免）或E14 Q&A 6.1（支持 "延迟再极化导致促心律失常效应的可能性较低 "的依据）。 假设ICH S7B hERG和体内QT研究的结果显示心室复极化没有延迟，其将使监管机构和临床医生确信，实验药品不会对参与首次人体研究的健康志愿者造成风险要使用非临床 hERG和体 QT结果（双阴性）作为临床TQT研究的替代方法（E14 Q&A 5.1）或替代物（E14 Q&A 6.1），应具备以下条件： • 统一标准方案； • 实验条件遵循S7B Q&A 中概述的最佳实践（Q&A 2.1；hERG和3.1-3.5体内QT检测）；以及 • 监管审查报告的一致性。 S7B的体外hERG问答（用于膜片钳的问答2.1）提供了以下方面的指导： • 记录生理温度（35-37 °C）、应遵循的电压协议； • 记录 hERG 电流质量的测量方法； • 测量或计算的主要终点（如IC50、希尔系数和置信区间）；浓度验证；以及 • 阳性和阴性对照的使用。 S7B的体内QT检测问答（问答3.1至3.4）提供了以下方面的指导： • 种属选择与ICH S7B一致，选择与毒理试验一致的适当的、可自由活动的非啮齿动物物种； • 超过预期治疗浓度--倍数越高，对 E14 Q&A 6.1 中 QTc 检测灵敏度的依赖性越小（即 QTc 变异性的统计测量；以毫秒为单位检测 QTc 变化的最小显著差异，包括浓度 QTc 分析，E14 Q&A 6.1 要求，Q&A 5.1 建议）； • 使用个体动物心率校正方法--包括 QTc/RR 散点图，评估检测灵敏度和实验室历史灵敏度（最小可检测差异）。 只有在问答6.1中才要求检测QTc（最小显著性差异）与临床研究中测得的阈值之间变化的化验灵敏度。最佳做法是报告体内QT化验的QTc最小显著性差异，以支持问答5.1，但没有最小阈值，该值仅用作衡量研究中QTc的变异性。最后，S7B Q&A 3.5是报告结果时应考虑的要点。 因此，非临床双阴性数据现在可以通过首次人体监管审查，以ICH E14 Q&A 5.1或6.1作为原发性心律失常的非临床-临床风险评估。预计这将增加TQT豁免申请的数量，并减少所需的临床TQT研究数量。ICH S7B最佳实践（Q&A 2.2-2.5）使用心肌细胞和前心律失常模型（Q&A 4）对心室再极化进行了后续体外评估（参考ICH E14/S7B Q&A）。 13 付诸实践：安全药理学案例研究 案例研究5-1和案例研究5-2重点介绍了如何将本章提供的信息付诸实践。 案例研究 5-1 对具有纳摩尔hERG抑制作用的小分子应进行哪些安全性药理学研究？ • 研究背景 一种小分子（新分子实体）正被开发为治疗神经退行性疾病的全身用药。该药物将作为口服片剂，每天服用一次。在非临床开发过程中，该分子在非人灵长类动物体内表现出对hERG通道的纳摩尔抑制作用（IC50 <100 nM）。 • 解决方案 对于这种针对神经退行性疾病开发的小分子药物，需要进行核心的安全药理学研究。由于该分子是作为每日口服片剂开发的，因此药物开发计划包括两项CV研究，以解决重复给药问题，并将药代动力学与CV测量相关联。此外，本着3R的精神，大动物CV研究与通过遥测技术收集呼吸信息相结合。在中枢神经系统方面，将FOB纳入为期28天的啮齿动物重复毒理学研究。 初步心肺研究采用非GLP方法，使用递增剂量设计（药效剂量和高于首剂的两个剂量水平（2倍和6倍）），使用三只非新药遥测仪器的非人灵长类动物。关键的GLP心肺功能研究是使用未经药物测试的非人灵长类动物进行的，这些灵长类动物通过手术植入了遥测仪器。 研究采用平行分组设计，共分四组（每组三只动物）；第一组动物服用对照组（载体）药物，其他三组动物服用递增剂量的试验药物，最低有效剂量为第二组。最低有效剂量（第2组），以及比最低有效剂量高2倍和6倍的剂量（第3组和第4组）。该研究设计根据表5-4所示进行了修改。 非人灵长类动物每天用药一次，并在第-1、1、2、4和第7天收集CV和呼吸功能遥测数据。第8天，动物再服药一次，以便在第8天和第9天（服药后24小时）采血进行药代动力学分析。 这些心肺功能研究（包括非GLP和GLP）的结果表明，在每天一次、连续7天服用6倍有效剂量的情况下，该分子在体内没有心血管风险，因此支持其继续开发。 案例研究 5-2 对于有癫痫发作风险的小分子药物，应该进行哪些安全性药理学研究？ • 研究背景 一种需要每天口服两次的小分子钠通道阻断药物正在作为镇痛药进行开发。在开发过程中对大鼠和犬进行研究，发生惊厥的血浆暴露量高于患者可能出现的暴露量，犬的暴露量约为临床有效剂量的10倍，大鼠的暴露量约为临床有效剂量的45倍。 • 解决方案 需要进行适当的体外研究，以评估已观察到的抽搐的潜在机制。 可能需要进行犬脑电图研究，记录大脑的自发电活动，以便 • 确认中枢神经系统不良反应的性质，并确定抽搐是由于癫痫发作还是其他毒理效应（如晕厥或明显的运动障碍）引起； • 在观察到抽搐和其他中枢神经系统症状（如肌阵挛）时，确认血浆暴露量； • 确定可能是惊厥或癫痫发作前兆的临床表现，这些临床表现可作为临床试验的终点指标；以及 • 确认在未观察到惊厥的较低剂量下无脑电图异常。 脑电图研究通常包括视频脑电图和从用药前至少24小时到最后一次用药后至少24小时的连续记录。研究开始前72小时，将对所有犬进行连续脑电图记录和分析筛查，以评估是否存在异常脑电图形态，然后再分配到研究中。研究组的最小动物数为8人（通常为4雄4雌）。选择的剂量水平将包括尽可能高的脑电图 "未观察到效应水平 "（no observed effect level）和观察到抽搐的较高剂量水平，以确认中枢神经系统事件的性质。 研究设计可能具有适应性，一些研究组的剂量水平将根据之前实验组的结果进行选择。虽然这不是研究的主要目的，但研究还将确认惊厥是否具有自限性，并对治疗任何药物诱发的惊厥的紧急药物（如地西泮、苯妥英或丙泊酚）进行潜在评估。 当观察到严重的中枢神经系统临床症状时，将在计划外的时间点采集毒代动力学样本（包括重要的代谢物），以精确量化这些事件期间的血浆暴露量，并同时分析脑电图痕迹。重复给药的持续时间将超过重复剂量一般毒理学研究中诱发惊厥所需的持续时间。为避免速发型过敏症，将包括 1 个月的洗脱期。 鉴于大鼠脑电图研究的安全系数较高，而且犬的数据将说明这种责任的特征，因此可能不需要进行大鼠脑电图研究。 14 摘要和结论 多年来，安全药理学研究不断发展，以跟上不断变化的药物类型。尽管如此，安全药理学研究仍然侧重于在临床试验中首次给药前对潜在的不良药理作用进行评估。 安全药理学界已经产生了高质量的功能数据，用于评估药物的安全性，这些数据可以单独使用，也可以与重复给药毒理试验结合使用。过去二十年来的改进主要集中在最佳实践（如使用数字数据收集、适应和改进技术以降低压力）、致力于 3Rs 原则以减少动物和笼具的使用、单个动物心率校正、QTc/RR散点图等方面。 尽管如此，大多数这些细节的评估在整个行业中并不统一，也没有系统地纳入研究报告中。随着ICH S7B Q&As的发布，这些细节、统计测量和校正以及更多内容需要纳入最终报告中。为了实现这一单一目标，核心组合安全药理学研究一直侧重于首次人体试验，通常是单剂量和小样本量研究，并持续收集数据。根据所测试的药品或生物制药的药理学，可对研究进行修改，以适应后续研究中的其他设计。 在候选药物筛选阶段进行的各种安全药理学研究--体外hERG研究、CiPA计划中检测hERG阻滞和QT延长的能力，以及体内测试--避免了药物在临床开发后期因前心律失常而暂停。这就需要整合体外hERG和体内QT检测的非临床数据以及临床数据，以便对QT/QTc延长进行综合风险评估，如果在控制良好的非临床研究中未观察到hERG阻滞或QT/QTc延长，则有可能放弃或减少彻底的TQT临床研究。 对心血管系统的评估，单独的安全药理学研究是黄金标准，而不是整合在毒理试验中，但整合的安全药理学研究将继续用于小分子和大分子药物，以符合3Rs的要求，只要以严格和可解释的方式收集安全药理学终点，以阐明药物对结构和生理功能的影响。对于大多数CV研究而言，具有体温采集和呼吸功能的植入式遥测设备现在已被接受，而且比外套式遥测设备更为普遍，这为收集更可靠、更一致的心电图和呼吸波形铺平了道路，从而可进行更准确的分析，便于与毒性研究相结合。目前，S7A和S7B/E14指南中没有具体涉及细胞和基因治疗，因为它们正在迅速发展，但不久后可能也需要纳入指南范围。有必要继续评估安全药理学研究数据的转化效果，以减少临床试验中的失败。 英文版原文 （上下滑动查看更多）  Chapter 5 Safety Pharmacology Studies  Adverse pharmacodynamic effects may be due to the on-target primary pharmacology effects of the product being tested, which could be related to the given dose, the route and frequency of administration, and systemic exposures, or due to off-target effects termed as secondary pharmacology. The three primary vital organ systems included in the safety pharmacology core battery are physiologically correlated, meaning that effects seen in one system may induce an adaptative response in the others. As such, interpretation of safety pharmacology data typically requires an integrated risk assessment of the totality of effects on organ functions that considers the targeted clinical population, clinical trial plans, and safety margins. The timing of safety pharmacology studies, which are aligned with the intended patient populations, will be discussed in this chapter. Safety pharmacology has emerged as a discipline to predict risk of adverse pharmacodynamic liability3 through the conduct of core battery studies before performing the first-in-human studies with a new product. These have helped to separate out safer pharmaceuticals with either little or no potential for CV, respiratory, or CNS effects or which have adequate safety margins from those which have a less favorable benefit-risk profile. It should be noted that safety pharmacology assessments may also be required for products in the late stages of development if adverse effects arise in clinical trials or if a marketed product is being repurposed for a new indication, patient population, or administered in a new formulation or route which previously did not require safety pharmacology assessments. The information presented in this chapter is largely based on US Food and Drug Administration (FDA),1 European Medicines Agency (EMA), and Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) documents that discuss the International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) Safety (S) guideline 7A on safety pharmacology studies for human pharmaceuticals. The ICH S7A guidance states that all human pharmaceuticals (small molecules, biotechnology-derived, or biologics) should be reasonably safe to be given to humans during first-in-human clinical trials. As such, the first dose in humans is not expected to have any undesirable pharmacodynamic effects on the physiological function of vital organs at the therapeutic range and above, as evaluated by safety pharmacology studies conducted in accordance with good laboratory practice (GLP) regulations.4 The timing of the safety pharmacology studies is aligned with the guidance from FDA and EMA/CHMP on ICH M3(R2) on nonclinical safety studies for the conduct of human clinical trials and marketing authorization for pharmaceuticals.5,6 Currently, cell and gene therapy products or tissue-engineered products are not specially addressed in the Safety Pharmacology guidelines. This chapter also will discuss the more recently approved and implemented ICH E14/S7B Q&A guidance, which outlines the acceptance of in vitro hERG (human ether-a-go-go related gene) and in vivo QT interval study data (i.e., nonclinical, double negative), both conducted under the Q&A best practice recommendations in support of two clinical scenarios (E14 Q&A 5.1 and 6.1), to apply for a thorough QT (TQT) study waiver.7,8 Case studies are provided at the end of this chapter to demonstrate how safety pharmacology studies may be conducted in practice. 1.General Principles and Importance of Safety Pharmacology Testing Safety pharmacology guidelines were first developed in 2000 in response to the adverse reports of the effects of the antihistamine terfenadine on the CV system. Terfenadine, which had been introduced into the market by Hoechst-Marion Roussel (now Sanofi-Aventis) in 1985, was marketed as Seldane in the US, Triludan in the UK, and Teldane in Australia as a treatment for allergic rhinitis, among others.3 In the 1990s, however, some people taking terfenadine presented to the hospital with syncope, and in some instances, died. 3,9,10 It was later found that terfenadine is a potent inhibitor of the potassium ion channel (IKr or hERG) resulting in prolongation of the QT interval. 9-11 This had the potential to develop into a polymorphic ventricular tachycardia termed Torsades de Pointes (TdP), which literally means twisting of the points or peaks (R wave or QRS complex) around the ECG isoelectric line. The cardiotoxic potential of terfenadine was not detected prior to clinical trials because the drug was completely metabolized by the liver enzyme cytochrome P450 3A4 (CYP3A4), so levels went undetected in the plasma. Moreover, its metabolite terfenadine carboxylate (also called fexofenadine), did not inhibit the potassium ion channel even when levels were at 30 times higher concentrations than the hERG IC50 of terfenadine.11,13 The proarrhythmic potential of the prodrug terfenadine was revealed at very high doses, however, in patients with liver disease affecting the CYP3A4 enzyme or when patients were taking other medications that inhibited CYP3A410,13,14as this resulted in reduced metabolism and thus higher plasma levels of terfenadine and lower concentrations of fexofenadine. Fexofenadine had similar efficacy to terfenadine, but since it only slightly inhibited the hERG channel, it had much lower potential to induce arrhythmia. Fexofenadine was marketed in 1996 under the name Allegra13 for allergic rhinitis and chronic urticaria, among others, and was listed in the WHO Essential list of Medicines,15 while Terfenadine was withdrawn from the market in 1997 due to its potential to cause cardiac arrhythmia. Hence, the potential adverse effects of small molecules or biopharmaceuticals on all three core organ systems (CV, respiratory,CNS) must be conducted before performing first-in-human studies.1,2 While ICH S7A provides guidance on the conduct of the core battery studies and the functional endpoints to collect, it does not outline the study designs themselves. Safety pharmacology study designs for both in vitro and in vivo studies are discussed in the next section and are provided as examples which may be judiciously applied or modified according to the pharmacology (or class of compound), route and dose, indication and intended patient population of the pharmaceuticals or biopharmaceuticals under evaluation. 2.Core Battery Study Designs and Endpoints When testing the safety pharmacology of a new product, the potential adverse pharmacodynamic effects need to be tested first on the three core organ systems: the CV system, the respiratory system, and the CNS. 3.Cardiovascular System Types of studies that may be performed to assess the effects on the CV system include: • In vitro studies (e.g., cardiac ion channel studies) • Ex vivo studies (e.g., Langendorff technique) • In vivo studies (e.g., telemetry in rodent and non-rodent models) 4.In Vitro Cardiovascular Studies In vitro CV assays mostly involve the study of cardiac ion channels, with the regulatory requirement to conduct a hERG assay7,8,17 (Table 5-1). One such assay is the automated hERG assay to determine the potential of pharmaceuticals to inhibit the hERG potassium channel. Using a single concentration of the test article, this assay is used as a screening tool early in drug development to identify compounds with potential hERG liability during structure-activity relationship research efforts and before leadnomination.  Discovery hERG assays are followed up by using escalating dose concentrations of the test article to get an estimation of its IC50, which is the concentration of the drug that is required to inhibit a biological process by 50%. This is then followed by a rigorous manual patch clamp hERG assay in accordance with GLP regulations. The recently released S7B Q&As request following up the in vitro hERG assay. Best practices for experimental factors are then conducted on human embryonic cells or Chinese hamster ovary cells overexpressed with human cardiac ion channels (S7BQ&A 2.1)21,22, which includes potassium, calcium, and sodium channels. Highlights of the Q&A best practices for experimental factors set out in ICH guidance include: • Conducting manual patch clamp experiments at near physiological temperature (35-37°C); • Measuring the ventricular action potential voltage protocol; • Monitoring health of the cells overexpressing the cardiac channels; • Recording seal resistance quality; and • Reporting the IC50 value and Hill coefficient Moreover, a validated analytical method should support concentration verification, and one of the three positive controls –dofetilide, ondansetron, and moxifloxacin – should be evaluated as a reference drug. Regarding the latter, repeated evaluations should be done with two or more concentrations of the test article being used for each experiment and including at least four cells at each concentration. After consideration of protein binding and using free drug concentrations in plasma, the calculated IC50 concentration inhibition should have greater than 50-fold safety margin over that of anticipated clinical exposures. Assessment of additional cardiacion channels is recommended and included in the Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay (CiPA) initiative, mentioned later in this chapter. When evaluating oncology products, hERG and cardiac ion channels inhibition assays can be conducted without compliance to GLP regulations because of the likely greater benefit to risk ratio of oncology products versus other pharmaceuticals. For biologics or biotechnology products, the target specificity is usually very high, and so in vitro hERG assays are not required but are recommended. When evaluating these biopharmaceuticals, CV endpoints can be incorporated in vivo in to repeat-dose toxicity studies conducted using non-invasive telemetry (Table 5-2). 5.Ex Vivo Langendorff Technique The Langendorff technique is an ex vivo assay in which the isolated heart of an animal is perfused with oxygenated, buffered Krebs solution, with and without the drug to be tested. The aim of this is to observe the effects of the drug on ECG parameters, heart rate, left ventricular mechanics, and estimates of coronary blood flow.26,27 Usually, the heart of a guinea pig or rabbit is used, as their hearts possess the IKr potassium ion channel, which is the primary cardiac ion channel responsible for ventricular repolarization (i.e., the QT interval of the ECG) in humans. Studies have demonstrated concordance to human effects of QT prolonging drugs using the ex-vivo assay. Translation of the isolated perfused guinea pig (rodent) heart assay to large animal QTc assay for determination of QTc changes with drugs known to prolong QTc and 13 drugs known to have no effect on the QTc interval was demonstrated. To perform the technique, the animal’s heart is removed, and the perfusate is introduced via the aorta in a retrograde fashion; this delivers the oxygenated, nutrient-rich perfusate containing either the vehicle or drug through the coronary arteries. Endpoints recorded include ECG parameters recorded from electrodes placed on the heart’s epicardial surface in a Lead II configuration, heart rate, left ventricular contractile parameters (e.g., the maximal rate of rise and maximum rate of fall in ventricular pressure), and mean coronary flow. The effect of the test drug on the function of the myocardium (electrical and contractile activity) and the coronary vessels can be examined by examining the myocardium, smooth musculature, and the endothelium of coronary vessels. Despite having some limitations (e.g., inability to assess metabolites, functional viability of the heart performance isolated for greater than 4 to 6 hours, etc.), the Langendorff technique can provide rapid information as both a CV screening assay and when further interrogation of results from earlier discovery assays (e.g. receptor binding assay on cardiac receptors or hERG results) is needed, as this assay generates an ECG for evaluation of intervals (e.g., RR, PR, QRS, QT and calculated QTc intervals), rhythm and left ventricular pressure curve. 6.In Vivo Cardiovascular Studies In vivo CV studies involve the evaluation of the CV system in free-moving (non-rodents like canine, non-human primates or minipig) animals via surgically implanted telemetry devices 30,31. Such devices are available with several biopotential and pressure catheter configurations as well as options for impedance leads for measurement of respiratory function 32,33. There are telemetry device options for use in both short and long term studies, as well as reuse of animals on multiple studies (with sufficient washout period), typically based on the battery life of the transmitter. Implanted telemetry, which uses solid tip ECG electrodes that are placed intravascularly, provides high resolution or low signal to noise ratio. This allows for accurate placement of fiduciary marks on the ECG intervals during post-acquisition analysis. Additional options include non-invasive jacketed external telemetry (JET), which pairs surface electrodes with a small, implanted telemetry device for collection of arterial blood pressure (required for compliance with ICH S7A CV studies) where the electrical components are secured in a jacket pocket.34 It should be noted that the small (rodent) telemetry device lacks the ability to collect continuous body temperature. CV endpoints collected in these studies are listed in Table 5-2. Telemetry studies using internally instrumented animals are convenient to perform, as the animals can move freely, and once surgically implanted and recovered, the animal can be re-used in several CV studies provided the previous test material has already cleared from their system and sufficient washout periods are allowed between studies. When the implanted telemetry device records both CV and respiratory parameters as set out in the ICH safety guideline 7A, the studies are termed cardio-respiratory studies. Stand-alone CV or cardio-respiratory studies are usually conducted in non-rodents in a 4 x 4 Latin square cross-over design, where each animal is dosed with the vehicle control and three dose levels of the test drug at low, mid, and high doses, in a random fashion following a washout period (typically 3-7 days). The statistical power of this design is superior to parallel or escalating dose designs as each animal serves as its own control, and any sequence effect is mitigated by the inclusion of all dose levels at each session (Table 5-3). This design uses the least number of animals (four in total) which is in keeping with the 3Rs of animal use – replace, refine, reduce – and can be modified for group housing options or to increase statistical power. Test articles with long half-lives (e.g., oligonucleotides, monoclonal antibodies, and biologics) where a washout period exceeds 7 days can use a parallel study design. This design consists of four groups of four to six animals that can be included in a stand-alone telemetry study (safety pharmacology environment), or alternatively, the CV safety pharmacology assessment can be incorporated in the parallel repeat dose toxicology study (toxicology environment). Males only can be used if there is no difference in exposures; otherwise, use both males and females. Recovery groups are often only in control and high-dose groups, so use four animals with no recovery animals in the low- and mid-dose groups. Considerations include scheduling of surgery for implanted telemetry and costs of implants. In some cases – and based on overall program considerations – escalating study designs can also be appropriate where animals receive a vehicle control, low-, mid-, and high-dose option sequentially (Table 5-4). Safety pharmacology evaluates the acute effects of the test article, hence the recommendation to collect CV parameters on Day 1 following a single dose if integrated in a repeat dose toxicology study. If the kinetics of the test article allow, CV parameters can be collected on Day 2 when all Day 1 activities are done because the excitement generated by Day 1 dosing and all the other activities, such as blood collection for toxicokinetics, clinical pathology, and clinical observations can have undue effects on CV parameters. CV studies measure arterial blood pressure (systolic, diastolic, and mean arterial pressure), heart rate (beats/min), Lead II ECG parameters (ECG intervals and rhythm) and body temperature. Qualitative ECG analysis includes a description of waveform morphology (for P, QRS, and T waves) and any arrhythmias, and quantitative measurements include ECG interval durations (RR,PR, QRS, and QT). The QT interval should be corrected for heart rate (QTc) using an individual heart rate correction method. The advantage of CV telemetry is that it generates a robust dataset by collecting data on every heartbeat and the arterial blood pressure is monitored continuously from at least 1-hour predose through to 22 hours postdose. Collecting beat-to-beat CV data captures pharmacodynamic effects, if present, at onset through Cmax and to recovery. The beat-to-beat data that is collected can be categorized into 1-minute means for data processing. Quantitative ECG intervals (PR, QRS, and QT) are measured for each normal heartbeat and heart rate can be expressed either as the interval between two consecutive RR intervals or from a count of each blood pressure pulse. CV telemetry studies are conducted according to GLP regulations. An optional toxicokinetic phase can be added to a stand-alone CV safety pharmacology study, in the same animals following a washout from the CV phase, as a repeat Latin square design, conducted as a dose escalation (low, mid and high) with washout between doses, or as a single dose (low, mid or high) administered once to all four animals after washout from the CV phase. The toxicokinetic study can also be performed in a separate group of animals and in this option, a single toxicokinetic data collection should be conducted as part of the CV study, for confirmatory concentration but not at Cmax to avoid disturbing the animals during CV telemetry data collection. The addition of a single toxicokinetic collection during CV monitoring can also be considered. When done, this collection is planned after Tmax to correlate exposure from the CV session with full exposure profile. 7.Respiratory System Assessment Core respiratory studies include measures of the respiratory rate, tidal volume, and minute volume as the major study endpoints assessed because they capture direct effects on lung mechanics but also indirect respiratory effects which may originate from CNS respiratory centers, based on ICH S7A guidance 1,2 (Table 5-2). Additional endpoints that can be assessed when a respiratory liability is identified or suspected are oxygen saturation and airflow to the tracheobronchial tree (resistance, airflow, flow durations), the ease of lung motion and filling (compliance, elasticity), and alveolar gas diffusion.1,2,40 Visual observations of the respiratory rate are not sufficient to meet ICH S7A guidance critera1,2 and respiratory parameters should be quantified with fully characterized methodologies. Most respiratory studies include evaluation of the effects of pharmaceuticals on ventilation patterns and in some cases blood oxygen saturation. When direct effects on the respiratory system are expected, advanced monitoring methodologies beyond the core battery may be considered such as pressure-volume loops of pleural pressures to quantify changes in airway resistance which can be caused by bronchoconstriction. Rodent species (rats are used more than mice) are most often used for respiratory safety pharmacology studies. These studies use plethysmography to measure changes in volume in the airways.40 Several plethysmograph configurations can be considered for use in rodents including whole body, head-out, and nose-only. All these configurations can be used to measure the respiratory rate and tidal volume, but the whole-body plethysmography has the advantage of not requiring the animals to be restrained. Plethysmography requires an acclimation period either to the whole-body chamber or to the restraint period typically for up to 4 hours postdose for data collection. A typical study design for most small molecules is a single administration in a stand-alone respiratory study, using a parallel design with four groups of animals of at least eight animals per group which are given a single low, mid or high dose of the test substance or a control substance (Table 5-5). To reduce the use of animals, the rodent respiratory study can also be conducted using the Latin square cross over design. Baseline data in these studies should be collected before the first dose is given and postdose data collected immediately post dose up to 4 hours later. If the assessment of the test article’s pharmacokinetics requires a longer duration, whole-body plethysmography can be used to collect data at additional timepoints up to 24 hours postdose in the rodent. Respiratory studies in rodents can also be incorporated in repeat-dose toxicity studies whereby a subset of the study animals is assigned and a designated day during the first week of dosing (i.e., Day 3) is reserved to measure respiratory endpoints (Table 5-6). Animals could either be single-sex, with eight (8) females per group to keep from exceeding the plethysmography chamber (and 6 males used for CNS) or 5 per sex if both sexes are included due to sex differences in exposures. Safety pharmacology assessments are conducted on Day 1 for acute dosing effects or during Week 1 and last week of dosing if conducting assessments of long-acting pharmaceuticals or biologics. No assessments on the recovery animals are done. Similar to a stand-alone respiratory safety pharmacology study, a respiratory evaluation within a repeat-dose toxicity study will use plethysmography following appropriate acclimation of the study animals, with data collected pre- to 4 hours postdose. In non-rodent studies, the main study animals will be evaluated using non-invasive jacketed external telemetry equipped with respiratory inductance plethysmography (JET-RIP) bands, or in animals that have a cardio-respiratory telemetry device surgically implanted. Optional data collections can be performed at the end of dosing for repeat-dose toxicity studies and at the end of recovery period. A key component to improve sensitivity in a rodent respiratorynsafety pharmacology study is dosing. Dosing half the cohort of animals per group in ascending order (from control to high dose) and the other half in descending order (from high dose to control) will allow all animal groups to be exposed to the technicians in the room administering the dose and have time in the plethysmography chamber to recover from the stress of being handled during dosing. As indicated for CV studies, and for longer durations of assessment, a combined cardio-respiratory study in a large animal (i.e., non-human primates and dog, less so in minipig) is recommended. Parameters measured during the study can include breathing frequency (respiratory rate), tidal volume, minute volume (the product of respiratory rate and tidal volume and the measure of total ventilation), peak inspiratory flow, peak expiratory flow, enhanced pause, and inspiration and expiration times. Follow-up studies are established and may be performed to evaluate airway resistance, compliance, pulmonary arterial pressure, blood gases, blood pH, among others as warranted. 8.Central Nervous System Evaluation The effects of pharmaceuticals on the CNS are usually measured using a functional observation battery (FOB)41 or modified Irwin42 assessment. CNS core safety pharmacology studies can be conducted as standalone using a rodent species consistent with the toxicology studies, or rodent CNS safety pharmacology studies are also often incorporated in repeat-dose toxicity studies (Tables 5-5 and 5-6). FOB and Irwin are good first assays to comply with ICH S7A requirements, but the main concern with these assays is their subjective and qualitative nature, as might be expected with behavioral testing. Follow-up safety pharmacology studies with quantitative CNS measures may need to be performed if there are signs or observations of adverse effects on the CNS, such as seizure liabilities, in which case, an electroencephalogram (EEG) may be necessary. FOB and Irwin observational assessments aim to evaluate motor activity, behavioral changes, coordination, sensory-motoractivity , sensory-motor reflexes responses, and body temperature. A typical study for investigating most small molecule test articles is a single administration, parallel group design, stand-alone CNS study, with four groups of at least six rats per group (single sex; males if no exposure differences are anticipated) which are administered the control or test substance at low, mid and high doses. Animals are socially housed, with up to three animals per cage based on their dose group allocation. The trained CNS technician conducting the FOB or modified Irwin assessment is typically blinded to the treatment. Data should be collected prior to dose administration, either the day before (i.e., pretreatment) or on the day of dosing (baseline). Dosing is staggered to allow time for the same technician to conduct the FOB or modified Irwin assessments at select time points postdose. The differences between the FOB and modified Irwin assessments are the subtleties in how the animals are handled during the observational battery. The FOB typically will have an assessment around Cmax, and 24 hours postdose, whereas the modified Irwin may have up to five observations up to and including Cmax to 5 hours postdose, or 24 hours if effects are still detected at 5 hours postdose. The FOB and Irwin assessments also can be incorporated in repeat-dose toxicity studies to assess dose range, duration, reversibility of behavior, and physiological functions. Depending on the intended human population, rodents of different ages (neonatal, juvenile, adult) or pregnancy status can be used in the study, with six main animals (single sex) per group or five main animals per sex. If conducting these assessments as part of repeat dose toxicology studies, males are typically assigned to the CNS study while the females are assigned to the respiratory study (Tables 5-6). Again, animals are first acclimatized to the experimental room prior to being randomized and distributed in groups; this is usually done as part of the toxicity study protocol. A particular day within the toxicity study is scheduled for the FOB or Irwin assessments to be carried out, and the animals are dosed with the control substance and three dose levels of the test article at a designated baseline time point and then placed back in their home cage; the animals are then observed at selected time points up to 24 hours postdose. Dosing can be staggered during the evaluations so that a single observer can collect and record all parameters from several animals and treatment groups at each timepoint. The objective is to determine the highest dose that is tolerated with no observed adverse effect and determine the lowest dose that causes noticeable adverse effect on the behavior of the animals. In the Irwin assessment, several observations are included: · Socially housed home cage observations which include posture, unusual behaviors such as convulsion, shivering, vocalization, stimulation, and stereotypy; · Handling observations, such as ease of removal, handling reactivity, body tone, salivation, lacrimation or piloerection; ·  Motor activity in open field including spontaneous motor activity, gait abnormalities, stereotypic behavior, irritability, piloerection, urination or defection; and · Autonomic activity assessment such as touch response, startle response, righting/palpebral/ grasping reflexes, tail pinch, thermal nociception, ataxia, body temperature and pupil response. · Clinical signs and body weights are also recorded. Observations that can be identified during FOB assessments include: · Ataxia; · Reactivity; · Catalepsy (lack of response to external stimuli); · Passivity (lack of response or absence of struggle); · Spontaneous motor activity (locomotor, rearing, grooming); · Social interaction; · Stereotypy (repetitive, purposeless behavior such as head bobbing, shaking, gnawing, licking); · Mortality; · Exophthalmia (protrusion of the eyeball assessed visually); · Gait (hypotonic or hypertonic- splayed posture to muscle weakness); · Grasping reflex (measured by wired maneuver which measures ability to grasp); · Grip strength; · Straub tail reaction (elevation of tail from horizontal); · Tremor (involuntary movements caused by alternating contractions of opposing muscle groups); · Convulsions (violent involuntary contractions of voluntary muscles which can be clonic with alternating contraction and relaxation of muscles, or tonic, which are sustained contractions, cramp-like or mixed clonic and tonic); · Diarrhea; · Lacrimation; · Piloerection (ruffling of fur); · Ptosis (partial or full eye closures due to drooping of upper eyelids, pupil size); · Rectal temperature;  Salivation; · Urination; · Corneal reflex (eye blink response); · Righting reflex (ability to rest or the body to its normal upright position); · Pineal reflex (response to retract or twitch the ear); · Tail pinch; and · Hot plate response In ICH S7A, screening and monitoring for potential adverse CNS effects by new pharmaceutical candidates with FOB or Irwin assessments is the first step in assessing CNS safety liabilities or risk to human safety, even though these tests are dependent on the skills of the person conducting the observational battery. The conglomeration of endpoints may need to be integrated to detect potential adverse events and not just individual parameters. Some endpoints do not translate directly to CNS adverse events in humans, and complete concordance cannot be ascertained. If an adverse effect on CNS is identified during an FOB or Irwin test, during a repeat-dose toxicity study or in clinical trials, follow-up studies (e.g., cognition and learning, fear and anxiety, etc.) and seizure liability assessments using electroencephalogram (EEG) may be needed to elucidate further the nature and mechanism of action of adverse CNS effect before continuing drug development. Observations in rodents such as sterotypies (i.e., head bobbing, scratching, excessive grooming and licking) often precede convulsions, and could be clonic or tonic. 9.Safety Pharmacology for Biologics or Biotechnology-derived Pharmaceuticals Safety pharmacology testing for biopharmaceuticals (i.e., biologics or biotechnology-derived pharmaceuticals) is covered by ICH S6(R1). Biopharmaceuticals are known for their selectivity (like antibody binding or ligands for receptors), and they are not expected to affect the CV or respiratory systems, or the CNS. However, they may have on-target exaggerated pharmacology, or potential off-target secondary pharmacology activity that may contribute to adverse effects on the vital organs that make up safety pharmacology. For the majority of biopharmaceuticals (large molecules or biotechnology-derived products), safety pharmacology endpoints are incorporated in the repeat dose toxicology studies according to ICH S6(R1).45 If, however, biopharmaceuticals are not highly selective for receptor binding, represents a novel or first-in-class product, or both, then stand-alone or follow-on studies for more extensive safety pharmacology evaluations (i.e., as per ICH S7A) may be necessary. For biopharmaceutical products which are active in rodents, safety pharmacological endpoints for CNS adverse effects (i.e., using FOB or modified Irwin assessments) are evaluated after a single dose or repeated dose administration; this depends on the test article’s route. of administration, dosing regimen. If the biopharmaceutical is active in non-human primates and rodents then adverse effects can be evaluated in both rodents and non-human primates, but if it is only active in the latter, then safety pharmacology endpoints are only incorporated into non-human primate repeat-dose studies. In some cases, in vitro CNS safety studies are conducted before in vivo studies are carried out,44 guiding the selection of safety pharmacology endpoints to include in repeat-dose studies and follow-up studies as appropriate (i.e., as per ICH S6(R1) guidance). 10.Safety Pharmacology for Oncology Products Safety pharmacology for oncology products is covered by ICH S9. For oncology products that are designed for late-stage cancers, there is a need to accelerate the clinical development of the drug candidate so they can be accessible to patients without undue delay. While no stand-alone (i.e., per ICH S7A) safety pharmacology studies are necessary, the assessment of adverse effects on the three vital organ systems (CV, respiratory, and CNS) can be incorporated in repeat-dose toxicity studies or limited to the assessment of ECGs (with scientific justification) collected from a large animal (e.g., dog, non-human primate, or minipig) toxicology study, according to ICH S9. Repeat-dose toxicity studies evaluating the three vital organ systems from the safety pharmacology core battery should be conducted in accordance with GLP regulations and with detailed clinical observations. In rodents (usually rats), repeat-dose studies usually incorporate the FOB or Irwin assessments, with half of the main study animals in the 28-day toxicity study (e.g., five of 10 males) undergoing assessment on Day 1, as well as detailed respiratory observations (e.g., five of 10 females), with treated groups being compared with the vehicle control group. In a non-rodent repeat-dose toxicity study, ECG and hemodynamic measurements (heart rate, blood pressure, and temperature) are collected in addition to detailed observations; these are collected at baseline (i.e., predose), on Day 1 (the first day of dosing) and during the last week of dosing (i.e., Day 28 or Day 90), including interim collection mid-study if warranted. Measurements from treated groups will be compared quantitatively with the control vehicle group and significant changes will be assessed and correlated with dose levels, toxicokinetic exposures, or both. If effects are identified during evaluations on the last week of dosing, CV, respiratory and CNS evaluations will generally be added to the recovery period to assess reversibility. The desire to accelerate the development of oncology products due to the potentially greater benefit to risk ratio is aligned with the lack of regulatory requirement for stand-alone pharmacology studies. As safety pharmacology assessments are incorporated in repeat-dose toxicology studies, patient safety can be adequately addressed while also adhering to the 3Rs of animal use according to ICH S9. When designing follow-up safety pharmacology studies for oncology products, the pharmacology and the clinical indication need to be considered and such studies are performed on a caseto-case basis (Table 5-7). They should be streamlined to reduce the number of animals especially for biopharmaceuticals and oncology drugs according to ICH S645 and ICH S946 and supplemental tests on these vital organs as well as other organs should also be done on a case-by-case basis (Figure 5-1). 11.Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay The Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay (CiPA)47,48 was developed in 2013 by the FDA with the goal of improving the assessment of proarrhythmic markers and to provide more relevant, reliable and comprehensive preclinical in vitro cardiac screening tools. This initiative was based around the potential for some pharmaceuticals (e.g., verapamil) to block the hERG channel however not to be proarrhythmic in humans. As its name suggests, CiPA includes an assessment of comprehensive list of cardiac ion channels that are involved in the ventricular action potential, and as such its use supports the requirement for hERG evaluation.49,50 The first step of CiPA is to conduct patch clamp assays on hERG transfected cells for six cardiac ion channels: hERG, Nav1.5 (late sodium), Cav1.2 (calcium), KvLQT1 (slow delayed rectifying potassium current; IKs), Kir2.1 (inward rectifying potassium channel responsible for membrane potential; IK1) and Kv4.3 (fast transient outward potassium current; Ito). The data from these patch clamp assays are then used to supply computer-simulated models of the human ventricular action potential that can provide information on potential early cardiac liabilities. The algorithms driving the computerized models can predict changes in the ventricular action potential (e.g., prolongation) as well as generation of any early afterdepolarizations. Early afterdepolarizations are the early triggers of proarrhythmic risk. The in silico models, such as the O’Hara Rudy model, which is an accurate model for healthy human ventricular action potential, are capable of assessing compounds that prolong the QT interval that is not associated with proarrhythmic risk (e.g., verapamil).51 Lastly, the patch clamp data through in silico modeling are assessed for translation against induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes (iPSc-CM). CiPA also includes the use of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM). These cells are assessed using multi-electrode array technology to measure the extracellular field potential of compounds, helping to identify those with potentially adverse effects on CV electrophysiology. Changes in the recorded field potential waveforms underlie changes in the ventricular action potential and could indicate blockage of the hERG or other ion channels, such as the sodium channel Nav1.5, which is responsible for the upstroke of the action potential or calcium channel Cav1.2, which is responsible for the duration of the actional potential. Hence a prolonged field potential duration could result in the prolongation of ventricular action potential and could indicate a prolongation of the QT interval recorded on the ECG. Drug-induced action potential prolongation should be distinguished from prolongation arising from the variability of cell-to-cell beating with the use of positive and negative control compounds.55 As indicated above, other potassium channels in addition to hERG, like Kir2.1, Kv4.3, KCNQ1/KvLQT1_mink) are also investigated during CiPA. 12.Safety Pharmacology for Other Organs Safety pharmacology studies for organ systems other than those included in the core battery can also be evaluated depending on the therapeutic indication and adverse findings in the toxicity studies. This includes the renal or urinary systems, the gastrointestinal system, and the autonomic nervous system, among others. Endpoints of such studies will depend on the system being tested, but may include the volume of urine excreted and electrolyte excretion, gastrointestinal transit time and gastric emptying, immunological parameters such as immune cell phenotyping, endocrine parameters such as hormone levels, and orthostatic hypotension. These parameters could be used to assess functional changes in these other organ systems. All pharmaceutical or biopharmaceutical drug candidates should be tested for safety pharmacology of these other organ systems as necessary, and on a case-by-case basis, with a fit-forpurpose study design, either during nonclinical drug development or before Phase 2 of clinical development. ICH E14/S7B Q&As - The Need for Nonclinical Studies for Clinical TQT Studies The need for nonclinical studies for clinical TQT studies is covered by ICH guidance E14 and the ICH S7B Q&As. ICH S7B was implemented in 2005 to guide the conduct of nonclinical safety pharmacology studies assessing the potential of new agents to prolong ventricular repolarization (QT interval) before first-in-human studies. That same year, ICH E14 was adopted, outlining the need to conduct a clinical study to assess the effects of these new agents on the potential to delay cardiac repolarization. The FDA has published data on the number of TQT studies conducted from 2016 through 2020 and found that 32% of studies failed to reach the E14 Q&A 5.1 threshold of 2X high clinical exposures. Additionally, another 24% of clinical studies had alternate study designs (82% of these were for oncology indications) where no TQT study could be conducted, therefore resulting in a label of “no large QTc effects.” In an effort to reduce the number of clinical TQT studies, E14/S7B Q&As were approved in February 2022, finalized in July 2022, and were implemented in August 2022.7,8 This guidance provides the opportunity to review the double negative nonclinical results (i.e., both hERG and in vivo QT/QTc studies are negative) in combination with clinical E14 Q&A 5.1 (in support of TQT waiver when clinical exposure does not reach 2x high clinical) or E14 Q&A 6.1 (to support labeling of “low likelihood of proarrhythmic effects due to delayed repolarization”). Assuming the results from ICH S7B hERG and in vivo QT studies show no delay to ventricular repolarization, they will give confidence to regulators and clinicians that the tested compounds do not pose a risk to healthy volunteers participating in first-inhuman studies. In order to use the nonclinical hERG and in vivo QT results (double negative) as an alternative (E14 Q&A 5.1) or as a substitute (E14 Q&A 6.1) for a clinical TQT study, there should be: · Alignment of standard protocols; · Experimental conditions that follow the best practices as outlined in S7B Q&As (Q&A 2.1; hERG and 3.1-3.5 in vivo QT assay); and · Consistency of reports for regulatory review. The in vitro hERG Q&As of S7B (Q&A 2.1 for patch clamp) provide guidance on:65 · Recording temperature (35-37 °C), voltage protocol to follow; · Measures of recording hERG current quality; ·  Primary endpoints to measure or calculate (e.g., IC50, Hill coefficient, and confidence intervals); Concentration verification; and · Use of positive and negative controls. The in vivo QT assay Q&As of S7B (Q&A 3.1 to 3.4) provide guidance on: · Species selection consistent with ICH S7B for appropriate, freely moving, non-rodent species consistent with toxicology studies; · Exceeding anticipated therapeutic concentrations – the higher the multiple, the less reliance on assay sensitivity for QTc under E14 Q&A 6.1 (i.e., statistical measure of QTc variability; least significant difference to detect changes in QTc in milliseconds, inclusion of concentration QTc analysis, required for E14 Q&A 6.1 and recommended for Q&A 5.1); · Use of an individual animal heart rate correction method -including QTc/RR scatter plots, assessing assay sensitivity and laboratory historical sensitivity (minimal detectable difference). The assay sensitivity to detect changes in QTc (least significant difference) to the threshold measured in clinical studies is only required under Q&A 6.1. It is best practice to report the least significant difference for QTc for the in vivo QT assay in support of Q&A 5.1, however, there is no minimal threshold and the value is used only as a measure of variability for QTc within a study. Finally, S7B Q&A 3.5 are points to consider for reporting the results. Thus, the nonclinical double negative data can now be advanced past first-in-human regulatory review for consideration with ICH E14 Q&As 5.1 or 6.1 as the nonclinical-clinical risk assessment for proarrhythmia. This is anticipated to increase submissions for TQT waivers and reduce the number of required clinical TQT studies. Follow-up in vitro assessments on ventricular repolarization are included in the ICH S7B best practice(Q&A 2.2-2.5) using cardiomyocytes and  proarrhythmia models (Q&A 4) (ICH E14/S7B Q&A reference). 13.Summary and Conclusion Safety pharmacology studies has evolved over the years to keep up with the changing modalities of pharmaceuticals. Nonetheless, they have remained focused on the assessment of potential adverse pharmacological effects prior to the first human dose being given in clinical trials. The safety pharmacology community has produced high quality functional data to assess drug safety, either as stand alone or in combination with repeat dose toxicology studies. The refinements over the past two decades have focused on best practices (e.g., using digital data collection, acclimation and refinement techniques to lower stress), and a commitment to the 3Rs principles to reduce the use of animals and social housing, individual animal heart rate correction, QTc/RR scatter plots, among others. That said, the assessment of most of these details is not standardized across the industry and are not systematically included in study reports. With the publication of the ICH S7B Q&As, those details, statistical measures and corrections and more need to be in the final reports. Towards this singular goal, core battery safety pharmacology studies have been focused on first-in-human studies, usually single dose and small sample size studies, with continuous data collection. Based on the pharmacology of the pharmaceutical or biopharmaceutical being tested, studies may be modified to accommodate other designs in follow-up studies. The conduct of various safety pharmacology studies – in vitro hERG studies, the ability to detect a hERG block and QT prolongation in the CiPA initiative, in addition to in vivo testing– which are undertaken at the screening stage of drug candidate selection, has staved off drug attrition due to proarrhythmia at the later stages of clinical development. This necessitated integrating the in vitro hERG and in vivo QT assay nonclinical data as well as clinical data for integrated risk assessments of QT/QTc prolongation, and the potential waiver and reduction of thorough TQT clinical studies if there is no observed hERG block or QT/QTc prolongation in well-controlled nonclinical studies. For CV assessments, stand-alone safety pharmacology studies are the gold standard rather than combination toxicology studies, but combination safety pharmacology studies will continue to be used for both small and large molecules, in keeping with the 3Rs and as long as safety pharmacology endpoints are collected in a rigorous and interpretable manner to elucidate effects of the pharmaceutical on both structural and physiological functions. For most CV studies, implanted telemetry devices with body temperature collection and respiratory capabilities are now acceptable and more prevalent than jacketed telemetry, paving the way to collect more reliable and consistent ECG and respiratory waveforms, leading to more accurate analysis that facilitate combination with toxicity studies. Currently, cell and gene therapy are not specifically addressed in the S7A and S7B/E14 guidance as they are rapidly evolving, but soon they may need to be included in the scope of the guidelines as well. There is a need to continue to assess the effects of translating the data garnered from the safety pharmacology studies to limit failures during clinical trials. Case Study 5-1 What safety pharmacology studies should be conducted for a small molecule that has nanomolar inhibition of hERG? • Background A small molecule (new molecular entity) is being developed as a systemic drug for neurodegenerative disease. The intention is that it will be administered as an oral tablet to be taken once daily. During nonclinical development, the molecule exhibited nanomolar inhibition of the hERG channel (IC50 <100 nM) in nonhuman primates. • Solution The core battery of safety pharmacology studies is required for this small molecule being developed for a neurodegenerative indication. As the molecule was being developed as a daily oral tablet, the drug development plan accounted for two CV studies to address repeat-dosing and correlate pharmacokinetics with CV measurements. In addition, in the spirit of the 3Rs, the large animal CV study was combined with respiratory collection via telemetry. For the CNS, FOB was integrated into the 28-day rodent repeat toxicology study. The preliminary cardio-respiratory study was conducted non-GLP using an escalating dose design (at pharmacologically efficacious dose and two dose levels (2X and 6X) above the first dose using three non-naïve telemetry instrumented nonhuman primates. The pivotal GLP cardio-respiratory study was conducted using drug-naïve nonhuman primates, which were surgically implanted with a telemetry device. A parallel group study design was used, with four groups of animals (three animals per group); animals in Group 1 were given a control (vehicle) substance and the animals in the other three groups received escalating doses of the test drug, at the lowest efficacious dose (Group 2), and at 2X and 6X above the lowest efficacious dose (Groups 3 and 4, respectively). This study design is modified from that shown in Table 5-4). Nonhuman primates were dosed once daily, and telemetry data for CV and respiratory function were collected on Days -1, 1, 2, 4 and Day 7. On Day 8, the animals were dosed one more time to enable blood collection for pharmacokinetic analysis on Days 8 and 9 (24 hours postdose). The results of these cardio-respiratory studies (both non-GLP and GLP) indicated no in vivo CV risk of the molecule at 6X the efficacious dose when administered once-daily for 7 days, supporting its continued development. Case Study 5-2 What safety pharmacology studies should be conducted for a small molecule that has a seizure liability? • Background A small molecule sodium-blocking drug that needs twice-daily oral administration is under development as an analgesic. Rat and dog studies have been used in its development but convulsions have been observed. The convulsions occurred at plasma exposures that are estimated to be higher than those likely to be seen in patients, at approximately 10X the efficacious clinical dose in dogs and 45X of the efficacious clinical dose in rats. • Solution Appropriate in vitro studies need to be conducted to evaluate potential mechanisms for the convulsions that have been observed. A dog EEG study which records spontaneous electrical activity of the brain68,69 will likely be required to: · Confirm the nature of the adverse CNS effects and establish if the convulsions were due to seizure or another toxicological effects (e.g., syncope or overt movement disorder); · Confirm the plasma exposure when the convulsion and other CNS signs (e.g., myoclonus) are observed; · Identify clinical signs that may be a precursor to the convulsions or seizures and that could be used as stopping criteria in clinical trials; and · Confirm the absence of EEG abnormalities at lower doses where no convulsions were observed. The EEG study will typically involve video-EEG68-70 and continuous recording from at least 24 hours prior to dosing until at least 24 hours after the last dose. All dogs will be screened with continuous EEG recorded and analyzed for 72 hours prior to study start to evaluate for the presence of abnormal EEG morphologies prior to assignment on study. The minimum group size is eight (typically four males and four females). The dose levels will be selected to include an EEG ‘no observed effect level’ ideally as high as possible and a higher dose level at which convulsions were observed to confirm the nature of the CNS events. The study design may be adaptative, with dose levels for some study groups being selected based on the outcome from the results with the previous experimental groups. Although not a primary objective, the study will also confirm if convulsions are self-limiting and potentially evaluate emergency drugs (e.g., diazepam, phenytoin, or propofol) to treat any drug-induced seizures. Toxicokinetic sample collections (including important metabolites) will be used at unscheduled timepoints when severe CNS clinical signs are observed to precisely quantify plasma exposure during those events and with concurrent analysis of EEG traces. The duration of repeat administration will be selected to exceed the duration that was required to induce convulsions in the repeated dose general toxicology study. To avoid tachyphylaxis, a 1 month wash-out period will be included. A rat EEG study will likely not be required given the higher safety margins in this species and the data from the dog that will characterize this liability. Chapter 6 Pharmacokinetic and Toxicokinetic Studies The goal of preclinical development is to generate sufficient data to allow an estimation of the benefit/risk profile of a new drug product prior to its use in patients. In general,the benefit(s) are ascertained from a combination of discovery phase studies in cells (i.e., in vitro) or animal-based (i.e., in vivo) models, and from reports in the scientific literature. The risk(s) are determined through a battery of nonclinical safety assessments. Pharmacokinetic (PK) and toxicokinetic (TK) studies – often simplified as a description of ‘what the body does to the drug’– are invaluable for this process as they provide a quantitative connection between the dose administered, and the amount of drug that is subsequently present internally at various times following dosing. When paired with a specific assessment of benefit (e.g., a reduction in cholesterol) or toxicity (e.g., cardiovascular dysfunction, such as evidence of QT interval prolongation on an electrocardiogram, ECG), this information can ultimately be used to develop and justify a clinical dosing regimen that maximizes the benefits of the drug, while minimizing its risks. This chapter will start with a brief overview of PK/TK itself, including an introduction to drug disposition and several other key background concepts. This will be followed by a discussion of the specific global regulatory recommendations/requirements pertaining to the conduct and interpretation of PK/TK analyses, largely from the International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use(ICH). Finally, the chapter will end with a description of how the results of PK and TK analyses should be presented in marketing and pre-marketing submissions to global regulatory bodies. 参考文献：（上下滑动查看更多） All references verified 16 February 2023. 1. US Food and Drug Administration. Guidance for Industry: S7A safety pharmacology studies for human pharmaceuticals. Current as of July 2001. https://www.fda.gov/media/72033/download 2. International Council for Harmonisation. ICH harmonized tripartite guideline. Safety pharmacology studies for human pharmaceuticals. S7A. Current as of 8 November 2000. https://database.ich.org/sites/ default/files/S7A_Guideline.pdf 3. Pugsley MK, Authier S, Curtis MJ. Principles of safety pharmacology. British J Pharmacol. 2008;154(7):1382-99. https://bpspubs. onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1038/bjp.2008.280 4. 21 CFR Part 58: Good Laboratory Practice. Current as of 24 October 2022. https://www.ecfr.gov/current/title-21/chapter-I/subchapter-A/part-58 5. 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引言G蛋白偶联受体在心房颤动(AF)中起关键作用。Spexin是一种新型的丙氨酸受体( GALRs)配体。2024年5月10日，哈尔滨医科大学潘振伟、杨宝峰、张志仁及李悦共同通讯在Circulation（IF=38）在线发表题为“Spexin Diminishes Atrial Fibrillation Vulnerability by Acting on Galanin Receptor 2”的研究论文，该研究证明，Spexin通过作用于丙氨酸受体2减少心房颤动易感性。该研究表明，房颤患者的Spexin血浆水平低于非房颤患者，敲除Spexin会增加小鼠的房颤易感性。SPX-KO小鼠心房钾内整流通道亚家族J成员2 (KCNJ2)和肌磷脂(SLN)上调；同时，SPX-KO小鼠离体心房肌细胞I K1电流升高，Ca2+处理受损。GALR2-cKO小鼠，而不是GALR1-cKO和GALR3-cKO小鼠，具有更高的AF发生率，这与更高的IK1电流和细胞内Ca2+过载有关。SPX-KO和GALR2-cKO小鼠心房组织中环AMP反应元件结合蛋白1 (CREB)磷酸化水平上调。染色质免疫沉淀证实了p-CREB在KCNJ2和SLN的近端启动子区域的募集。最后，spexin处理抑制CREB信号，降低IK1电流和细胞内Ca2+过载，从而降低了 Ang-II注入小鼠AF的诱导性。总之，Spexin通过抑制CREB磷酸化，从而下调GALR2受体对KCNJ2和SLN的转录，从而降低房颤易感性。spexin/GALR2/CREB信号通路为房颤药物的开发提供了一条新的治疗途径。房颤(AF)是最常见的心律失常，具有相当高的发病率和死亡率，其治疗伴有不良的心房重构。目前治疗房颤的药理学策略疗效有限，且存在一定的不良反应。发现与房颤病理生理机制相关的新靶点可能会开辟新的治疗途径。房颤的进展是心房电和结构重构、自主神经失衡、Ca2+处理改变、代谢异常和遗传因素的结果。电重构导致心房有效不应期(AERP)和动作电位持续时间(APD)缩短，并导致APD适应性的丧失，这涉及到伴随的离子活性改变慢性房颤患者的离子通道重塑包括L型Ca2+电流(ICa, L)密度降低，向内整流K+电流(I K1)振幅增加和细胞内Ca2+处理紊乱。心脏SERCA2a(肌浆网Ca2+-ATP酶2a)参与Ca2+进入肌浆网的再摄取，并关键地决定了肌浆网(CaSR)中的钙含量和心脏的兴奋-收缩偶联。PLN(磷蛋白)和SLN(肌磷脂)是心脏SERCA泵活性的关键调节因子。细胞内Ca2+处理的变化降低了心房肌细胞的收缩功能，缩短了心房肌细胞的动作电位，诱发房颤。心房IK1密度的增加和细胞内Ca2+处理的紊乱在APD缩短和房颤的发生中起着关键作用。抑制心房IK1电流和恢复细胞内Ca2+处理具有开发房颤新药的潜力。模式图（Credit: Circulation）Spexin，也被称为神经肽Q，是最近发现的一种由14个氨基酸组成的肽激素。它广泛产生于大脑，包括下丘脑，以及周围组织，如胃肠道、肺、胰腺、肾脏、肾上腺和脂肪组织。Spexin也被分泌到血液可以改变器官和组织的生理功能。研究表明，肥胖儿童的spexin循环水平低于体重正常的同龄人此外，spexin是运动改善肥胖诱导的胰岛素抵抗和2型糖尿病的潜在介质。它涉及体内平衡功能，如代谢、能量稳态和生殖等。为了发挥这些作用，spexin结合到膜甘丙肽受体2 (GALR2)和甘丙肽受体3 (GALR3)，但不结合到甘丙肽受体1 (GALR1)。在之前的研究中，spexin可以保护心肌细胞免受缺氧诱导的代谢和线粒体功能障碍。该研究系统检测了spexin对AF易感性的影响及其分子机制。研究证明spexin通过GALR2/CREB(环AMP响应元件结合蛋白1)途径抑制Kir2.1和SLN的表达，从而减轻AF的易感性。Spexin/GALR2/CREB信号轴通过调控KCNJ2和SLN转录影响心房电重构和细胞内钙稳态，从而参与房颤的发病。Spexin治疗可抑制心房颤动的易感性，可能是一种治疗心房颤动的新药物。原文链接https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.123.067517责编|探索君排版|探索君文章来源|“iNature”End往期精选围观一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版）热文Nature | 破除传统：为何我们需要重新思考肿瘤的命名方式热文Nature | 2024年值得关注的七项技术热文Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望热文CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述