53BP1

【导读】 奥希替尼是第三代表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(EGFR- tki)，已被批准用于EGFR T790M耐药突变患者，作为EGFR阳性患者的一线或二线治疗。对奥希替尼的耐药将不可避免地发生，而潜在机制基本未知。 9月4日，天津医科大学陈军教授研究团队在期刊《Cell Death&Disease》上发表了研究论文，题为“L3MBTL1, a polycomb protein, promotes Osimertinib acquired resistance through epigenetic regulation of DNA damage response in lung adenocarcinoma”，本研究中，研究人员发现肺腺癌细胞对奥希替尼的获得性耐药与异常的DNA损伤反应(DDR)相关。研究人员还发现，L3MBTL1调节染色质结构，从而促进DDR和奥希替尼耐药。EGFR癌基因抑制降低了L3MBTL1的泛素化，同时稳定了其在奥希替尼耐药细胞中的表达。降低L3MBTL1和奥希替尼处理均能显著抑制奥希替尼耐药肺癌细胞的DDR和增殖。L3MBTL1在整个基因组中结合并在EGFR-TKI耐药中发挥重要作用。它还与53BP1竞争H4K20Me2，并在体内外抑制奥希替尼耐药肺癌细胞耐药性的发展。 本研究结果表明，抑制L3MBTL1是克服EGFR - TKI获得性耐药的一种新策略。 https://www.nature.com/articles/s41419-024-06796-2#Sec11 背景知识 01 根据2022年发布的最新《世界癌症统计报告》，肺癌是就发病率和死亡率而言的世界第二大恶性肿瘤。在过去几十年中，肺癌治疗取得了显著进展。然而，总体生存率仅约为15%。由于其较高的响应率和较低的毒性，表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）已成为携带EGFR-TKI敏感突变的晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者的一线治疗药物。然而，大多数患者在使用第一代靶向药物吉非替尼或厄洛替尼治疗4-12个月后会出现药物抵抗，导致肿瘤复发和转移。对第一代EGFR-TKIs的耐药可能由多种机制引起，包括次要EGFR突变（如T790M）、MET基因扩增或激活其他通路分子。旨在克服第一代EGFR-TKI耐药性的第三代EGFR-TKI奥希替尼（AZD9291）已获得上市批准。奥希替尼不可逆地靶向EGFR外显子19缺失、L858R和T790M突变，并已获批用于所有EGFR阳性患者的第一线和第二线治疗，以对抗T790M耐药突变。尽管其疗效显著，但对奥希替尼的耐药性仍会发展，不幸的是，对奥希替尼的耐药性会赋予对所有当前EGFR抑制剂的耐药性。因此，有必要识别克服获得性奥希替尼耐药的潜在机制。 基因组DNA对于细胞稳态至关重要，因为它是主要的遗传信息载体。许多环境和内源性因素持续攻击基因组DNA。DNA双链断裂（DSB）是最严重的DNA损伤效应。在不断进化和生长的过程中，细胞进化出一套复杂的DNA损伤响应（DDR）系统来应对内部和外部环境引起的基因组不稳定。该系统监测DNA损伤，修复它，调节细胞周期，并改变染色质结构。研究表明，改变DDR或抑制损伤修复通路会导致耐药性；然而，尚不清楚DNA损伤减少是否导致奥希替尼耐药性。 L3MBTL1对耐药肺癌细胞对奥希替尼敏感性的体外影响 02 为了评估L3MBTL1敲低对H1975/AR细胞药物敏感性的影响，研究人员采用CCK-8法测定细胞对奥希替尼的IC50值。在si-L3MBTL1-1和si-L3MBTL1-3敲低L3MBTL1后，与对照组相比，IC50值分别降低了31.9%和50.9%（p<0.05和p<0.01）。研究人员还用慢病毒对H1975/AR细胞进行L3MBTL1敲低，在L3MBTL1 shRNA敲低组中，与对照组相比，IC50值降低了72.3%，这支持了之前的发现。另外，研究人员还研究了一种强效且选择性较高的MBT抑制剂UNC669，其对L3MBTL1的亲和力比其他MBT家族同源物更高。单独给药时，UNC669不会影响细胞存活。然而，当与奥希替尼以固定浓度联合给药时，在奥希替尼浓度为16 µM时，抑制率超过95%（相比之下，奥希替尼单独给药时为67%）。计算的组合指数为0.4，表明存在显著的协同作用，这意味着UNC669与奥希替尼联合使用可能对抑制细胞生长具有协同作用。相反，CCK-8分析显示，在过表达L3MBTL1的H1975细胞中，IC50值增加了103.8%，表明对奥希替尼产生耐药性。此外，降低L3MBTL1表达显著提高了PC9/OR细胞对奥希替尼的敏感性，将IC50值降低了44.2%。 L3MBTL1抑制增强了EGFR-TKIs在体外的抗肿瘤效果 为了研究L3MBTL1表达是否与奥希替尼协同作用于H1975/AR和PC9/OR细胞，研究人员将细胞分为五组：随机序列组、奥希替尼单药治疗组、L3MBTL1敲低组、依托泊苷组和L3MBTL1敲低加奥希替尼治疗组。克隆形成实验表明，L3MBTL1敲低后细胞增殖减少。此外，L3MBTL1敲低与奥希替尼治疗相结合时（p<0.001），以及在PC9/OR细胞的L3MBTL1-3敲低组中，细胞增殖显著减少。这些发现表明，抑制L3MBTL1与奥希替尼治疗相结合可显著降低H1975/AR细胞的增殖能力。综上所述，本研究结果支持以下假设：在NSCLC细胞中敲低L3MBTL1可提高奥希替尼的敏感性，而L3MBTL1过表达则赋予奥希替尼耐药性。 L3MBTL1对体内肿瘤生长和耐药性的影响 03 研究人员利用裸鼠皮下注射H1975/AR sh-NC和H1975/AR sh-L3MBTL1细胞建立肿瘤异种移植模型，以研究L3MBTL1在奥希替尼耐药中的作用。当肿瘤体积达到150-200 mm3时，将每种细胞类型的小鼠分为两组，一组通过灌胃给予双蒸水，另一组给予奥希替尼（2.5 mg/kg/day），H1975/AR sh-NC小鼠作为对照组给予依托泊苷。研究表明，L3MBTL1敲除组的肿瘤生长速度和体积显著低于对照组，联合奥希替尼治疗组显示出更强的抑制作用。在石蜡包埋的组织切片中，L3MBTL1敲除加奥希替尼组肿瘤组织中Ki-67的表达显著低于其他组，而γ-H2AX和53BP1的表达增加。这些发现表明，L3MBTL1敲除可抑制肿瘤生长并增加DNA损伤。 研究小结 04 总之，本研究阐明了DDR与奥希替尼耐药之间的联系。这可能为治疗对奥希替尼产生耐药的患者识别出新的治疗靶点。研究人员发现，L3MBTL1是非小细胞肺癌（NSCLC）对奥希替尼产生获得性耐药的关键因素。体内和体外实验表明，L3MBTL1的缺失可通过调节DDR显著降低药物耐药性。本研究结果表明，测定L3MBTL1的表达可能是一个有用的预测EGFR-TKI耐药的生物标志物。 【参考资料】 https://www.nature.com/articles/s41419-024-06796-2#Sec11 【关于投稿】 转化医学网（360zhyx.com）是转化医学核心门户，旨在推动基础研究、临床诊疗和产业的发展，核心内容涵盖组学、检验、免疫、肿瘤、心血管、糖尿病等。如您有最新的研究内容发表，欢迎联系我们进行免费报道（公众号菜单栏-在线客服联系），我们的理念：内容创造价值，转化铸就未来！ 转化医学网（360zhyx.com）发布的文章旨在介绍前沿医学研究进展，不能作为治疗方案使用；如需获得健康指导，请至正规医院就诊。 热门推荐活动 点击免费报名 🕓 北京｜09月20日-21日 ▶ 第五届单细胞技术应用研讨会暨空间组学前沿研讨会 🕓 上海｜11月15日-16日 ▶ 2024第一届中国类器官转化医学大会 点击对应文字 查看详情

引言 DNA双链损伤修复主要包括同源重组修复（HR）， 非同源末端修复（NHEJ）和可替代末端修复（A-EJ）。A-EJ主要在HR和NHEJ抑制的情况下起主要作用，这也是其名字的由来。例如在细胞有丝分裂期（M-phase），Brca2缺失的S/G2期，或Ku70/80或Lig IV缺失的G1/G0期 (复制前期)。A-EJ的主要组分包括Polθ, Polλ, Parp1/2, XRCC1和 Lig I/III，这些因子之间存在冗余性，在特定的条件下，使用哪些组合以及如何调控的并不清楚。 斯坦福大学医学院Frock团队以小鼠前体v-Abl B淋巴细胞为研究对象，结合高通量DNA损伤修复捕捉技术Rejoin-HTGTS【1，2】，发现在Ku70缺失的复制前期，前体v-Abl B淋巴细胞仍然能通过Parp-XRCC1-Lig III A-EJ修复轴进行有限的V(D)J重组，且受到ATM和53BP1的调控。2024年7月31，相关工作发表在Science Advances, 题目为ATM and 53BP1 regulate alternative end joining-mediated V(D)J recombination。 论文深入研究了A-EJ介导的V(D)J重组的特征。例如，在复制前期，存在微同源（microhomology）和片段删除（deletion）等A-EJ修复特征，但并没有出现明显的片段插入（insertion），因此也没有发现Polθ在该条件下起作用，尽管Polθ是细胞有丝分裂期的关键A-EJ因子【3，4】；而干扰Parp、XRCC1、Polα、ATM和53BP1对微同源的利用有不同程度的影响，并且Parp1和ATM有显著的叠加效应（图1）。 图1.A-EJ相关因子在V(D)J重组中微同源利用率的作用（Credit: Science Advances） V(D)J重组的过程中，还可能伴随少量病理性的染色体易位（chromosome translocation），在小鼠细胞中染色体易位主要通过A-EJ介导，因此，在Ku70缺失的细胞中，进一步敲除53BP1导致染色体易位大量减少，这与V(D)J重组减少一致。而ATM的缺失使染色体易位明显增多，可能是因为ATM阻止原修复中心解离(图2）。有意思的是，Parp1敲除或者Parp1/2抑制的条件下却没有观察到明显的变化，这是由于基因组层面出现了更多的DNA损伤平衡了其A-EJ连接能力的下降。 图2.ATM和53BP1对A-EJ介导的染色体易位的影响（Credit: Science Advances） A-EJ在许多癌细胞中高表达，不但使得通过细胞损伤杀死癌细胞变得困难，还增加了癌细胞进一步变异的能力。因此，A-EJ的主要成分被作为治疗癌症的靶点。目前，Parp作为靶点的许多治疗癌症的药物已经用于临床治疗，Polθ的一些癌症治疗药物也进入了临床二期。进一步深入研究A-EJ修复和调控机制也将为癌症治疗提供新的思路。 参考文献 1. Liang, Z., Kumar, V., Le Bouteiller, M., Zurita, J., Kenrick, J., Lin, S.G., Lou, J., Hu, J., Ye, A.Y., Boboila, C., et al. (2021). Ku70 suppresses alternative end joining in G1-arrested progenitor B cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 118. 10.1073/pnas.2103630118. https://www.pnas.org/doi/full/10.1073/pnas.2103630118 2. Wang, J., Sadeghi, C.A., and Frock, R.L. (2024). DNA-PKcs suppresses illegitimate chromosome rearrangements. Nucleic Acids Res. 52, 5048–5066. https://academic.oup.com/nar/article/52/9/5048/7614868 3. Gelot, C., Kovacs, M.T., Miron, S., Mylne, E., Haan, A., Boeffard-Dosierre, L., Ghouil, R., Popova, T., Dingli, F., Loew, D., et al. (2023). Polθ is phosphorylated by PLK1 to repair double-strand breaks in mitosis. Nature 621, 415–422. https://www.nature.com/articles/s41586-023-06506-6 4. Brambati, A., Sacco, O., Porcella, S., Heyza, J., Kareh, M., Schmidt, J.C., and Sfeir, A. (2023). RHINO directs MMEJ to repair DNA breaks in mitosis. Science 381, 653–660. https://www.science.org/doi/10.1126/science.adh3694 https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adn4682 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述

炎症和基因组不稳定都是癌症的主要特征。炎症到癌症的三部曲：炎症←→ DNA损伤→癌症。Cancer Discov . 2022 炎症与基因组不稳定之间的关系人们普遍认为，基因组不稳定性是癌症的标志，炎症会导致基因组不稳定 。人类单倍体基因组包含 3.2×109个碱基对，正常人细胞的自发突变率估计约为 1×10-10个核苷酸/细胞/分裂。在同一细胞谱系中需要几个驱动突变才能成为恶性，尽管必要突变的数量尚未确定，并且可能取决于癌症的类型，但最小数量约为三个。人体大约有 3×1013 个细胞，人类平均寿命包括 1016  个细胞分裂。根据 Loeb 的说法，任何一个细胞获得三个突变的概率近似为10-14个潜在癌细胞/一生 。换句话说，人群中癌症的患病率应该比观察到的患癌症概率低几个数量级。遗传、环境暴露和生理病理（包括炎症状况）等其他因素使突变频率超过正常速率，这种质量称为突变体表型 。因此，虽然只需要几个突变来促进癌症，但增加的突变率不仅会导致所需的癌症驱动突变，还会导致数十个甚至数百个相关突变。越来越多的证据表明，炎症是导致加速诱变和基因组不稳定的因素之一。炎症导致DNA损伤和突变大多数炎症引起的DNA损伤是由RONS（reactive oxygen and nitrogen species）引起的，RONS是由免疫细胞进化而来破坏病原体的，但它也会损害附近的人体细胞。Archives of Toxicology (2023)NO是一种多效性 RONS ，浓度低于 400 nM 是信号转导分子，然而，在炎症期间，先天免疫细胞产生高水平的NO（接近μM水平）。此外，中性粒细胞和巨噬细胞产生超氧化物（O•2 −），自由基（例如，超氧化物，羟基自由基•OH和二氧化氮NO•2），阴离子（例如，过氧亚硝酸盐ONOO和亚硝基过氧碳酸酯ONOOCO2 -）、酸酐（例如亚硝酸酐N2O3）、次卤酸（例如次氯酸 HOCl 和次溴酸 HOBr）和过氧化氢 （H2O2）。RONS 产生的 DNA 损伤，包括核碱基氧化、脱氨、卤化和烷基化，以及磷酸二酯骨架的链断裂。氧化许多 RONS 是有效的氧化剂，可以产生多种 DNA 损伤。虽然有许多潜在的 DNA 氧化产物 ，但鸟嘌呤是最容易氧化的 DNA 碱基，是亲核 RONS 反应的主要靶标。RONS对鸟嘌呤的初级氧化产生8-氧代鸟嘌呤（8oxoG，致突变）和8-硝基鸟嘌呤（不稳定并迅速成为非碱基位点）。8oxoG 的氧化倾向是其母体鸟嘌呤的 ~1000 倍，导致产生几种更稳定和，的二级产物。除二次氧化外，还可以还原8oxoG，打开咪唑环形成2,6-二氨基-4-羟基-5-甲酰胺基嘧啶（FapyG）。FapyG在哺乳动物细胞中产生 G→T 转位，它可能比亲本 8oxoG 更具致突变性 。脱氨基作用除氧化外，亚硝化RONS还可以使DNA碱基脱氨。脱氨产物特别具有致突变性。因为化学反应发生在决定氢键的官能团上，改变氢键供体和受体的模式，并导致碱基错配。主要负责碱脱氨的化学物质是亚硝酸酐，从典型碱基生成产物次黄嘌呤 （Hx）。体外研究表明，NO 化学导致 DNA 中高水平Hx，并且 Hx  在发炎组织中也升高。胞嘧啶或其甲基化形式5meC 的脱氨作用，分别将碱基转变为尿嘧啶或胸腺嘧啶，导致 C→T 转换。在所有癌症中都发现了与 5meC 自发脱氨相对应的突变特征。卤化除了活性氧和氮外，炎症细胞还可以产生次卤酸。Chem. Res. Toxicol. 2024中性粒细胞分泌髓过氧化物酶以产生次氯酸 （HOCl） ，嗜酸性粒细胞分泌嗜酸性粒细胞过氧化物酶以产生次溴酸 （HOBr）。这些次卤酸在炎症过程中很容易与DNA反应，形成加合物。在小鼠模型中，最丰富 5-氯胞嘧啶（5CLC）的积累程度高于氧化、脱氨或脂质过氧化引起的DNA 损伤。5ClC 已被证明在遇到任何类别的 DNA 聚合酶时会引起 C→T 突变。脂质过氧化（Lipid Peroxidation，LPO）氧化对DNA碱基本身直接造成损害，也可以通过其他生物分子造成间接损害。具体来说，当RONS遇到多不饱和脂肪酸时，它们会引起脂质过氧化，从而产生亲电的DNA反应性醛类。这些醛类中研究得最多的是 4-羟基-2-壬烯醛 （HNE）、丙二醛 （MDA）、丙烯醛。HNE 和 MDA 可直接致癌。由此产生的 LPO 诱导的 DNA 加合物是两个 （ε，etheno-） 或三个 （P， propano-） 碳在碱基上的外环加成。DNA 中发现的最丰富的 etheno 加合物是 N2,3-εG 。N2 ，3-εG 是 G→A 转变的有效诱导剂，其异构体 1，N2 -εG 可引起 G→T 和 G→C 转化 。单链断裂 （Single Strand Breaks，SSB）虽然碱基上的损伤是突变的重要来源，但DNA骨架断裂对基因组完整性的威胁要大得多。链断裂会增强大规模序列重排突变，例如缺失、插入和易位，如果不能有效修复，它们还会导致应激信号转导、细胞周期停滞和细胞毒性 。双链断裂 （Double Strand Breaks，DSB）双链断裂（DSB）也来自多种来源。一些酶（如核酸内切酶和拓扑异构酶）会切割骨架以产生 DSB 。SSB 还可以增强 DSB ，例如，两个相距不到 7 个碱基对的相对 SSB 会降低DNA 双链体的结构完整性，导致断裂成两个 DSB 末端 。 DSB 是最有害的 DNA 损伤类型之一 ，可增强大规模突变，包括插入、缺失、易位和序列重排 。DNA损伤促进炎症炎症的DNA损伤信号DNA损伤反应中有许多因素会促进炎症。例如，PARP1（聚（ADP-核糖）聚合酶 1）检测并结合SSB 以启动碱基切除修复（ Base Excision Repair，BER ）机制 。PARP1 在链断裂时从 NAD+ 中构建 ADP-核糖部分的支链聚合物（称为 PARylation），以帮助募集 BER 蛋白并启动修复。PARP1 还能够对蛋白进行翻译后 PARylation 以修饰其活性，特别是包括关键的炎症调节因子 NF-κB ，NF-κB复合体的几个组分在 PARylation 后显示出增加的活性 。DNA损伤通过细胞死亡和衰老促进炎症除了 DNA 损伤反应对炎症的直接上调外，DNA 损伤还通过细胞毒性间接促进炎症 。过多的 DNA 损伤，尤其是在增殖阶段，无法通过 DNA 修复途径充分处理，因此细胞最终被迫经历细胞凋亡、坏死、坏死或衰老。DNA损伤诱导的细胞凋亡通常不被认为是促炎的，事实上，大多数形式的凋亡细胞死亡都不是炎症性的。但是，也有例外。例如，Fas 配体充当 DNA 损伤传感器，激活 Fas 介导的细胞凋亡通路。坏死性凋亡是程序性细胞死亡的另一种形式，与坏死非常相似，并且比细胞凋亡更促炎。一种类型的坏死性凋亡，称为 parthanatos，是由 DNA 单链断裂时过度激活 PARP1 引发的。坏死性凋亡与坏死相似，两者都涉及肿胀和质膜破裂，释放细胞内内容物并促进炎症。通常不会在细胞外发现的分子被称为损伤相关分子模式（DAMP）。细胞外 DAMP（如 IL1家族细胞因子、尿酸、ATP 或 HMGB1）可触发免疫细胞（包括巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞和 B 细胞）的激活 .除细胞死亡外，DNA损伤还会导致衰老，其中细胞会永久停止生长，并分泌炎性细胞因子。衰老细胞产生衰老相关分泌表型 （SASP），其中包括释放许多炎性细胞因子 。随着时间推移，衰老由 SASP 信号转导以及持续的 DNA 损伤相关病灶（如激活的 ATM、γH2AX、53BP1 和 CHK2）。简评：炎症和DNA损伤的相互影响，持续放大炎症和DNA损伤，累积的结果，导致细胞恶变。参考文献Douglas Hanahan ， Hallmarks of Cancer: New Dimensions， Cancer Discov . 2022 Jan;12(1):31-46. doi: 10.1158/2159-8290.CD-21-1059.Loeb LA. A mutator phenotype in cancer. Cancer research. 2001;61(8):3230–9. PubMed PMID: 11309271.Klaudia Jomova  et al, Reactive oxygen species, toxicity, oxidative stress, and antioxidants: chronic diseases and aging，Archives of Toxicology (2023) 97:2499–25745‑Chloro-2′-deoxycytidine Induces a Distinctive High-Resolution Mutational Spectrum of Transition Mutations In Vivo，Chem. Res. Toxicol. 2024，https://doi.org/10.1021/acs.chemrestox.3c00358·············