KIR2DL4

摘要:自然杀伤（NK）细胞是癌症免疫疗法的有力候选者，它们具有强大的先天细胞毒性，并且在嵌合抗原受体（CAR）治疗方面比T细胞具有独特优势。对病毒载体的安全性、成本和可扩展性的担忧激发了对非病毒基因传递替代品的研究。本综述全面分析了非病毒遗传修饰NK细胞在异体CAR-NK疗法中的最近进展和挑战。包括电穿孔和多功能纳米颗粒在内的非病毒替代品在CAR表达和转化反应方面受到检验。至关重要的是，NK细胞生物学与药物传递技术设计之间的联系被建立起来，这对于未来非病毒方法的发展至关重要。本综述为非病毒CAR-NK细胞工程的现状提供了宝贵的见解，旨在实现基于NK细胞的免疫疗法的全部潜力。 图形摘要:非病毒生产“现成的”CAR-NK细胞。 1.NK细胞可以从捐赠者血液中纯化，从干细胞分化，或在实验室中从永生化细胞系生产。 2.从CAR-T设计修改而来的NK特异性CAR设计，包括NK跨膜域（NKG2D、NKp44）、共刺激受体（例如，DAP10、2B4）和NK细胞受体（NKG2D）。 3.非病毒遗传修饰NK细胞可以包括通过DNA或mRNA传递CAR构建体，以及使用基因编辑工具（例如，CRISPR Cas9、转座子）敲入/敲出特定基因。这需要一种基因传递方法，可能包括电穿孔、脂质和多功能纳米颗粒和细胞。 1.引言 嵌合抗原受体（CAR）疗法是一种过继细胞疗法，其中T细胞、树突状细胞、巨噬细胞或自然杀伤（NK）细胞被遗传工程化以识别和消除癌细胞。CAR-T疗法是最成熟的形式，涉及修改患者的T细胞在体外表达一个CAR，该CAR能够识别癌细胞表面的肿瘤相关抗原（TAA），例如在许多B细胞淋巴瘤和白血病上表达的CD19。然后CAR-T细胞被扩增并重新输回患者体内，以靶向并杀死表达特定TAA抗原的肿瘤细胞。第一个CAR-T疗法于2017年获得美国食品药品监督管理局（FDA）的批准，到2022年又有五个产品获得批准；针对CD19+恶性肿瘤，包括白血病和淋巴瘤，或表达B细胞成熟抗原（BCMA）的多发性骨髓瘤（在表1中总结）。 基本CAR结构（图1）模仿T细胞受体激活，包括几个部分：一个识别癌细胞表面的特定抗原的细胞外域；一个对将信号发送到细胞内域至关重要的跨膜域，激活CAR-T细胞增殖和存活。CAR-T构建体设计已经经历了几代的发展，如图1所示。目前商业化的CAR-T细胞产品使用第二代CAR设计，增加了一个共刺激域（CD28或4-1BB）以增强T细胞增殖、持久性和细胞毒性（表1）。共刺激域的选择可以显著影响体内持久性；基于CD28的CAR T细胞持续约30天，而4-1BB CAR T细胞在某些患者中可能超过4年。 图1. CAR-T构建设计元素进展的详细示意图。第一代CAR由单链可变片段（scFv）抗原识别域、跨膜域和源自CD3ζ链（CD3ζ）的细胞内T细胞激活域组成，发展到第二代CAR设计，增加了额外的共刺激域（CD28或4-1BB），增强了T细胞的增殖和细胞毒性，被商业产品所采用。进一步的第三代CAR构建包含两个不同的共刺激域（例如，CD28和4-1BB）。“武装”的第四代CAR（也称为T细胞重定向用于通用细胞因子介导的杀伤（TRUCKs））包含可诱导表达的成分，如细胞因子（例如，IL-12），这可以增加CAR-T细胞的激活和肿瘤杀伤，第五代或称为“下一代”CAR包含一个截短的白细胞介素-2（IL-2）受体β链（IL-2Rβ），具有与转录因子STAT3的结合位点，以充分利用通过JAK-STAT3/5信号传导的CAR激活信号；增强T细胞的激活、增殖和持久性。此图使用BioRender.com创建。 血液系统恶性肿瘤，包括白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤，迄今为止一直是CAR-T疗法的主要目标，治疗效果令人印象深刻。在2015年和2017年之间，针对tisagenlecleucel的第二阶段ELIANA临床试验，包括75名难治性或复发性B细胞急性淋巴细胞性白血病（ALL）的儿童患者，结果显示在三个月时的总体缓解率为81%。然而，73%的患者经历了严重的不良事件，其中47%发展为严重的细胞因子释放综合征（CRS）。CAR-T疗法的安全性问题是一个主要关注点，患者遭受的毒性包括CRS和肿瘤溶解综合征、神经毒性以及移植物抗宿主病（GVHD）的风险。此外，用CAR-T疗法治疗实体瘤已被证明更加困难，因为肿瘤异质性、炎症和肿瘤微环境中的免疫逃逸（TME）。与自体细胞疗法相关的成本也极高，CAR-T疗法的治疗费用从373,000美元到475,000美元不等，还有与白细胞分离、淋巴细胞清除疗法以及CAR-T免疫疗法的副作用相关的额外成本。例如，使用tisagenlecleucel治疗的患者的总治疗费用据报道，对于没有CRS的患者范围从478,777美元到对于有严重CRS的患者531,823美元，由于需要进一步的治疗和医院护理，包括在某些情况下的重症监护治疗。因此，有必要开发更安全的替代品，以减少患者的并发症风险，同时也有助于降低制造成本和与医院治疗相关的成本，以管理严重的副作用。这样的替代品之一是使用自然杀伤（NK）细胞进行CAR疗法，它们有潜力克服CAR-T疗法中的一些问题。 2.自然杀伤（NK）细胞 NK细胞是高度细胞毒性的免疫效应器，被定义为CD56+ CD3–淋巴细胞，能够发挥自然细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）。它们在癌症监测中扮演重要角色，具有对癌细胞的自发细胞毒性的独特能力，无需事先暴露或由其他免疫细胞刺激，这归功于一系列激活受体。NK细胞可以通过下调通常在健康细胞上表达的人类白细胞抗原（HLA），与主要组织相容性复合体（MHC）同义，或上调应激诱导配体，如主要组织相容性复合体类1链相关蛋白A和B（MICA, MICB）来识别异常细胞。在识别目标细胞后，NK细胞通过涉及多种受体、共受体和细胞内蛋白的复杂信号传导途径被激活，包括自然细胞毒性受体（NCRs）、杀伤Ig样受体（KIRs）、NKG2D和DNAM-1。许多NK激活和抑制受体协同作用，提供一种自我调节机制，以防止对健康细胞的损害，如图2总结，更详细的内容在表2中。 图2. NK细胞常见的激活性A和抑制性B受体及其相应配体的简化示意图。NK受体协同作用，提供一种自我调节机制，以防止对健康细胞造成损害，并且可能通过下调人类白细胞抗原（HLA，与主要组织相容性复合体MHC同义）或上调应激诱导配体（如主要组织相容性复合体类1链相关蛋白A和B，MICA，MICB）来识别异常细胞。在识别靶细胞后，NK细胞通过涉及多种受体、共受体和细胞内蛋白的复杂信号传导途径被激活，包括自然细胞毒性受体（NCRs）、杀伤细胞免疫球蛋白样受体（KIRs）、NKG2D和DNAM-1。此图使用BioRender.com创建。 抑制性受体识别HLA分子，使自然杀伤（NK）细胞能够区分正常细胞和异常细胞。当激活受体的平衡倾向于激活时，会释放含有穿孔素和颗粒酶B的细胞毒性颗粒，通过caspase介导的凋亡直接杀死目标细胞。NK细胞还表达死亡受体，如FasL、TRAIL和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）受体，以诱导表达相应受体的目标细胞凋亡。产生多种细胞因子和趋化因子，如干扰素-γ（IFN-γ）和TNF-α，激活其他免疫细胞，包括树突状细胞、巨噬细胞和T细胞，并促进炎症。此外，NK细胞能够通过识别被抗体包被的目标细胞进行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。成熟的NK细胞表达CD16受体（也称为FcγRIIIA），该受体识别与目标细胞表面表位结合的免疫球蛋白G（IgG）的Fc片段。与IgG包被的细胞相互作用后，含有免疫受体酪氨酸基激活基序（ITAM）的CD16亚基将受体连接到细胞内信号传导途径，触发肌动蛋白和微管的重组以实现ADCC。这最终导致含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒的释放，FasL和TRAIL死亡受体的参与，以及促进进一步招募多种免疫细胞的细胞因子和趋化因子的释放。CD16的表达对于NK细胞的ADCC功能至关重要，并且表达在更成熟的NK细胞上。因此，CD16的表达在命名法中用于分类NK细胞的成熟状态。人类NK细胞通常被细分为两个主要亚群：CD56brightCD16dim/−和更成熟的CD56dimCD16+。CD56dim亚群在外围血液中更为常见，而CD56bright在组织中更丰富。CD56bright NK细胞被认为是不成熟的，表达NKG2A但不表达KIRs。它们的细胞溶解能力差，分泌细胞因子IFN-γ、GM-CSF，并对IL-2或IL-15产生反应而增殖。相反，CD56dim被认为是成熟的，表达NKG2A和/或KIR受体，并在激活时具有强大的细胞溶解活性和细胞因子分泌能力。最成熟的、终末分化的NK细胞被分类为CD56dim KIRpos CD57pos CD16bright（图3）。成熟的CD56dimCD16+亚群是癌症治疗的理想选择，因为它们具有强大的细胞溶解活性和ADCC能力。因此，采用NK细胞的过继免疫疗法已成为一种有希望的治疗选择，研究正集中在探索如何利用NK细胞的力量用于癌症免疫疗法，如CAR-NK细胞疗法。[图3]。 图3. NK细胞成熟度与其他免疫细胞的相互作用。A. NK细胞根据成熟状态改变受体状态，从未成熟的CD56bright/CD16−细胞到成熟的CD56dim/CD16+细胞，以及最终分化的NK细胞，这些细胞有时也被称为“记忆样”NK细胞。B. NK细胞在激活后与髓系细胞和靶细胞的信号传递和相互作用。NK细胞通过直接杀伤（激活受体包括NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、KIRs）、凋亡（TRAIL和FasL死亡受体）和/或ADCC（CD16）对靶细胞发挥细胞毒性，并产生炎症细胞因子和趋化因子，这些因子刺激并招募其他免疫细胞。此图使用BioRender.com创建。 2.1.CAR-NK疗法的优势 与T细胞相比，NK细胞在CAR疗法中具有几个潜在优势，包括增强的安全档案、异体疗法的潜力以及通过CAR依赖和非CAR依赖的癌细胞靶向实现更广泛的目标特异性。CAR-Ts分泌包括IL-1、IL-2、IL6、TNF-α、MCP1、IL8、IL10、IL-15在内的一系列细胞因子。这些细胞因子，特别是促炎性的TNF-α、IL-1和IL-6，被报道是与CAR-T疗法相关的严重副作用的原因，包括神经毒性和CRS。相比之下，CAR-NK与不同的细胞因子档案相关，它分泌IFN-γ和GM-CSF。事实上，在给药CD19+淋巴样肿瘤患者后，CAR-NK细胞的炎症细胞因子并未超过基线。这种细胞因子释放档案的差异被认为是NK细胞增强安全档案的原因之一，导致毒性较小，减少细胞因子风暴的发生。尽管重要的是要注意这些结论是基于有限数量的临床CAR-NK研究和有限的患者数量，与许多大型CAR-T临床研究相比，并且尚未在CAR-T和CAR-NK疗法之间进行直接比较。CAR-NK细胞的另一个潜在安全优势是降低了与CAR-T细胞相关的靶向内肿瘤毒性的风险。所有细胞，无论是恶性还是非恶性的，如表达CAR靶抗原的CD19+ B细胞，都可能被CAR-T细胞靶向。NK细胞上的抑制性受体可能在非恶性细胞被CAR抗原识别时充当安全开关。如果识别非恶性细胞，将启动NK抑制信号，防止靶向内肿瘤毒性。 NK细胞在异体应用中的潜力在于CAR-NK细胞治疗后GVHD（移植物抗宿主病）的低风险。在T细胞的情况下，由于它们的αβ T细胞受体（TCRs）高度多变，供体T细胞与受体组织细胞广泛表达的HLA I类分子结合。在供体T细胞输注后，TCR识别HLA为外来物，启动针对受体细胞的免疫反应，导致导致GVHD的异体反应。相比之下，NK细胞的活性不依赖于HLA I类识别，允许NK细胞针对经常丢失HLA I类受体作为免疫逃逸手段的恶性细胞。因此，NK细胞治疗的GVHD风险较低，并且NK细胞的研究在安全性方面取得了有希望的结果。 由于安全性档案的改善和GVHD风险较低，有可能开发出一种“现成的”CAR-NK产品，这可能对领域产生变革性影响。尽管正在研究自体NK细胞治疗，但异体NK细胞可能比自体NK治疗更有效，克服了来自免疫抑制患者的耗尽NK细胞的问题。异体供体NK细胞可以大规模培养，便于更有效的质量控制测试、转染和输注；允许从同一批次治疗多名患者，这可能消除了对专业中心的需求。相比之下，目前CAR治疗中使用的T细胞通常来源于患者自身的细胞，这可能既耗时又昂贵，并且难以收获和工程化。自体CAR-T治疗的费用可能高达每次治疗475,000美元，由于CAR-T治疗劳动密集、难以扩展且容易失败。相比之下，一个周期的异体“现成的”NK-92治疗的费用可能不到20,000美元，使其成为一个更具成本效益的选择。需要注意的是，只有在多个患者之间共享工程化的异体NK细胞产品时，才能实现这样的成本节省。此外，生产异体T细胞的努力也在进行中，也可能有助于克服自体T细胞工程化过程中遇到的问题。 CAR-NK疗法可能在实体瘤治疗中具有潜力。CAR-T疗法在实体瘤中产生了令人失望的治疗结果，原因是诸如肿瘤异质性、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）、不足的交通和渗透以及毒性等障碍。CAR-NK细胞已在多种实体瘤中进行了研究，如胶质母细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌和胰腺癌，并且提出NK细胞的天然属性可能对治疗实体癌有益。与稳定过表达B细胞抗原的淋巴瘤相比，实体瘤通常具有可变的抗原表面表达水平和肿瘤内及原发与转移组织之间的异质性，使得用单一CAR目标成功治疗变得困难。除了任何CAR修饰外，NK细胞还有潜力通过多个激活和抑制受体识别异质性肿瘤细胞，尽管HLA-I分子的表达减少或缺失。激活信号的存在，如NKG2D，允许NK细胞直接对缺乏特定CAR抗原并可能被CAR-T细胞遗漏的转化细胞发挥其细胞毒性，这在异质性实体瘤环境中很常见。这是NK细胞相对于CAR-T细胞的一个明显优势，后者只对表达CAR抗原的细胞活跃，并允许NK细胞针对更广泛的癌细胞群体。实际上，即使没有CAR抗原的添加，未修饰的NK细胞已被用于针对癌细胞，并已在临床试验中显示出其有效性的早期迹象。此外，除了它们对癌细胞的直接细胞毒性效应外，NK细胞对于招募常规1型树突状细胞（cDC1）和随后的CD8+ T细胞也很重要，这将促进癌症免疫周期的激活，有潜力克服免疫抑制性TME。 3.CAR-NK 疗法的发展现状 目前市场上还没有获批的基于 NK 细胞的产品，但自 2016 年以来，研究 NK 细胞疗法的临床试验数量激增，截至 2023 年 5 月，已有近 60 项试验启动。该领域仍处于新兴阶段，大多数试验处于 I 期或 II 期，并且仍在进行中，因此结果尚未完全报告。然而，早期数据令人鼓舞，表明 CAR-NK 细胞疗法是安全的，并有潜力成为癌症的有效治疗方法，尽管尚未报告显著的临床效果。虽然针对多种抗原和恶性肿瘤，但相当数量的 CAR-NK 试验集中在针对 CD19 的血液癌症，这是 CAR-T 疗法成功的目标之一。一个针对 CD19 的 CAR-NK 细胞的例子是，一项 I/II 期临床试验，研究 CD19 靶向 CAR-NK 细胞在复发或难治性 CD19+ B 淋巴样恶性肿瘤患者中的安全性和有效性，包括急性淋巴细胞性白血病（ALL）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）和非霍奇金淋巴瘤（NCT03056339）。来源于脐带血的 HLA 不匹配 NK 细胞与 K562 饲养细胞共培养，并与 IL-2 一起在第 6 天通过逆转录病毒载体转导，表达抗 CD19 CAR、IL-15 以增强 CAR-NK 细胞在体内的扩增和持久性，以及诱导性 Cas9 作为安全开关，在不可接受的毒性效应情况下触发 CAR-NK 细胞的凋亡。扩增后，CAR-NK 细胞在第 15 天收获用于新鲜输注，并给与 37 名复发或难治性 CD19+ 癌症患者，包括非霍奇金淋巴瘤和 CLL。临床对疗法的反应基于 2018 年慢性淋巴细胞性白血病国际研讨会（iwCLL）的标准和 2014 年非霍奇金淋巴瘤的卢加诺分类。1 年总生存率为 68%，无进展生存率报告为 32%。重要的是，没有发生显著毒性，包括 CRS、神经毒性或 GVHD，炎症细胞因子水平也没有增加，包括 IL-6。这一有希望的临床结果和安全概况突出了 CAR-NK 疗法作为异体疗法的潜力，可以开发成“现成”产品。CAR-NK 细胞疗法治疗实体瘤的潜力推动了这一领域的研究，目前正在进行的几项临床试验涉及胶质母细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结直肠癌和胰腺癌。这些研究中的许多还处于非常早期阶段，仍在招募患者，因此结果尚未完全报告。最近，Burger 等人发表了第一项探索胶质母细胞瘤患者中 CAR-NK 细胞疗法的临床试验结果；一项 I 期试验，研究在复发手术期间颅内注射针对人表皮生长因子受体 2（HER2）的 CAR-NK 细胞在 9 名复发 HER2+ 胶质母细胞瘤患者中的疗效（NCT03383978）。这项研究调查了慢病毒转导的 NK-92 细胞表达 CAR，包括 HER2 特异性单链抗体、CD8α 铰链区和 CD28 及 CD3ζ 信号域。在手术期间将 CAR-NK 细胞注入手术腔边缘后，五名患者的病情稳定，持续了 7 至 37 周。四名患者病情进展，两名患者在注射部位出现假性进展，提示治疗诱导的免疫反应。对于所有患者，中位无进展生存期为 7 周，中位总生存期为 31 周。此外，没有剂量限制毒性，也没有患者发展为 CRS 或免疫效应细胞相关神经毒性综合征。这项研究表明 CAR-NK 细胞治疗胶质母细胞瘤的可行性和安全性。尽管这是一项非常侵入性的研究，需要在手术期间注射 CAR-NK 细胞，但需要进一步研究以评估 CAR-NK 细胞通过静脉输注靶向和渗透实体瘤的能力。希望这些有希望的结果也能在其他实体瘤类型中复制，早期阶段的临床试验正在进行中。 4.CAR-NK 生产考虑因素 尽管安全性和治疗结果令人鼓舞，但 CAR-NK 疗法仍处于起步阶段，在它们被批准用于临床之前还有很多工作要做。如果需要实现 CAR-NK 疗法的潜力，需要解决的一些考虑因素包括 NK 细胞的来源、CAR 结构设计以及 NK 细胞的遗传修饰方法。 4.1.异体 NK 细胞来源 异体 NK 细胞可从多种来源获得，包括外周血（PB）、脐带血（CB）、诱导多能干细胞（iPSCs）和永生化细胞系。这些来源在扩增和遗传修饰方面都有其独特的考虑因素，目前都在临床研究中。 从外周血（PB）和脐带血（CB）衍生的 NK 细胞 从 PB 或 CB 来源的 NK 细胞是获取 CAR 疗法 NK 细胞的主要方法，广泛用于 NK 细胞应用。然而，细胞增殖能力可能较低，细胞存活时间短。大约 85-95% 的 PB NK 细胞是 CD56dimCD16high，具有高度的细胞毒性，但与其产生细胞因子的 CD56bright 对应物（占 PB NK 的 5-15%）相比，增殖能力较低。相比之下，由于常规储存，CB 衍生的 NK 细胞可能更容易获得，并且比 PB NK 细胞更具增殖性，允许在体外轻松扩增。然而，CB NK 细胞在表型和功能上不成熟，可能不如其他来源的 NK 细胞具有细胞毒性。从 PB 或 CB 分离 NK 细胞后，需要扩增以创建异体剂量，由于治疗剂量所需的 NK 细胞数量大，这已被证明是具有挑战性的。扩增协议可分为基于饲养细胞的或无饲养细胞的系统。与饲养细胞（例如 Epstein-Barr 病毒转化的淋巴母细胞系（EBV-LCL））共培养，这些细胞向 NK 细胞呈现配体，刺激 NK 细胞的激活和扩增，相对快速地扩增到大量（几周内）。然而，使用饲养细胞与安全和监管问题相关，包括最终 NK 细胞产品中残留活性饲养细胞的潜力。因此，已开发了使用细胞因子和抗体刺激 NK 细胞的无饲养细胞扩增方法。包括 IL-2 和 IL-15 在内的细胞因子是强大的 NK 细胞刺激剂，但包括 IL-15、IL-21、IL-12、IL-18 和 IL-27 在内的一系列细胞因子组合已显示出扩增 NK 细胞的前景。虽然无饲养细胞系统避免了与饲养细胞相关的安全问题，但产生的 NK 细胞产量较低。将饲养细胞遗传修饰以表达刺激细胞因子的组合已产生高度细胞毒性和增殖性的 NK 细胞。例如，K562 饲养细胞遗传修饰以表达膜结合 IL-15 和 41BB 配体（K562mbIL12-41BBL）在培养 10 天内导致大量扩增 PB NK 细胞在透气静态细胞培养袋（G-REX）中。另一个可能影响 NK 细胞效力的因素是冷冻保存。从 PB 或 CB 来源的 NK 细胞可能在扩增前或在“现成”产品的情况下需要冷冻保存，这可能对 NK 细胞的增殖和细胞毒性功能产生不利影响。潜在的解决方案包括准备额外的细胞以弥补冷冻保存后的损失，或在解冻后立即用 IL-2 等细胞因子刺激，或用 IL-15 和 IL-18 预处理以提高冷冻保存后的活性。此外，在非病毒遗传工程方法的背景下，与 iPSCs 和细胞系相比，PB 和 CB NK 细胞仍然难以操纵。与 NK 细胞的培养和扩增相关的因素可能影响转染率，包括 NK 细胞的激活状态、扩增期间的转染时机、扩增方法（饲养或无饲养方法）和冷冻保存。病毒转导率在体外扩增（激活）的 NK 细胞中得到增强，而在静止的原代 NK 细胞中观察到较低的转导。大规模扩增 NK 细胞的标准协议需要在病毒转导前的初始扩增，然后是第二阶段的扩增。这种顺序的原代扩增、遗传编辑和次级扩增协议也适用于电穿孔，基于饲养细胞或无饲养系统的扩增方法和时机也可能影响转染率。饲养细胞可能通过诱导细胞分裂增强遗传编辑，饲养刺激可能支持 NK 细胞在体外操纵后的恢复。例如，Pomeroy 等人观察到在与 K562-mbIL-21-41BB 饲养细胞共培养的 PB NK 细胞电穿孔后第 4 天 TcBuster 的转位最高。根据协议阶段调整饲养细胞与 NK 细胞的比例（电穿孔前 2:1 饲养：NK，电穿孔后 48 小时 5:1 或所有随后扩增的 1:1）。同样，Gurney 等人使用 EBV-LCL（10:1 饲养：NK 比例）在 IL-2 和 IL-21 存在下激活 NK 细胞。NK 细胞在第 4 天电穿孔并在 IL-15 存在下休息 48 小时，然后重新刺激饲养细胞。进一步扩增进行到第 25 天，观察到不同捐赠者之间细胞扩增的变化。这突出了遗传工程和扩增 NK 细胞所需的优化的复杂性，并且一系列因素可能影响转导/转染率，尚未建立标准协议。需要进一步的研究来阐明最佳条件，并且可能需要根据基因传递方法定制条件。 iPSC 衍生的 NK 细胞 作为解决原始 PB 和 CB 衍生 NK 细胞问题的替代方案，iPSC 提供了无限的资源来生产同质 NK 细胞，并且可以在大规模上进行遗传修饰和扩增。从单一 iPSC 系生成的 iPSC 衍生 CAR-NK 细胞，然后进行分化和扩增，成为通用的细胞产品，有潜力成为“现成”疗法。2021年12月，Fate Therapeutics 的新闻稿详细介绍了一项 I 期研究的中期临床数据，该研究调查了表达 CD19 的“现成” iPSC 衍生 CAR-NK 细胞（称为 FT596），用于治疗复发/难治性 B 细胞淋巴瘤（NCT04245722）。FT596 iPSC CAR-NK 细胞被设计表达高亲和力不可切割的 CD16 变体，以增强 ADCC；一种膜结合 IL-15/IL-15R 融合蛋白，以支持体内持久性；以及针对 NK 细胞优化的抗 CD19 CAR，用于直接肿瘤靶向。据报道，接受第二个 FT596 周期治疗的 11 名患者中有 10 名持续反应，其中三名患者在≥6 个月的随访中持续完全反应。此外，FT596 治疗方案耐受性良好，没有剂量限制毒性，如神经毒性或 GVHD，尽管在 FT596 单剂量递增队列中有两例低级别不良事件的 CRS 报告，这些事件在未经重症监护治疗的情况下得到解决。这些早期数据突出了 iPSC CAR-NK 疗法的潜力，但在这种疗法在临床上更大规模推广之前，需要完成进一步的研究和优化。iPSC NK 细胞的一个问题是需要高度专业化的培养条件，其中 iPSC 被分化为 CD34+ 造血祖细胞，然后进一步分化为 NK 细胞。从 iPSC 生产 NK 细胞的成熟协议可能需要 4-5 个月，尽管最近开发了一种新方法，将处理时间缩短到大约 2 个月。控制 iPSC 的分化是一个劳动密集型的制造过程，需要遗传工程和细胞培养专业知识，这对于大规模生产财务上可行且能够被更广泛患者群体接受的“现成”产品可能是有问题的。此外，存在对 iPSC 遗传突变风险的主要关注，特别是当需要长时间的培养时。此外，还存在未分化 iPSC 潜在的肿瘤形成风险。因此，需要开发稳健的质量测试对 iPSC 衍生的细胞进行筛选，包括筛选在培养过程中可能发生的任何遗传改变。 NK 细胞系 迄今为止，已有 10 个永生化模型 NK 细胞系，包括 NK-92、KHYG-1、NKL 和 YT，它们是从 NK/T 淋巴瘤患者中建立的，并用于 CAR 疗法的临床前开发。NK 细胞系对恶性细胞具有高度的细胞毒性，并且比原始 PB 或 CB 来源的 NK 细胞更容易进行遗传修饰和扩增。尽管需要注意的是，与其他类型的细胞系相比，NK 细胞系更难培养，因为它们对培养条件的变化非常敏感，通常需要添加细胞因子 IL-2 或 IL-15 来支持增殖。由于 NK 细胞系的恶性特性，因此在转移给患者之前需要进行辐射处理，这可能对输注的 NK 细胞的存活和细胞毒性效应产生不利影响。尽管如此，NK-92 细胞已获得 FDA 批准用于临床使用，到 2021 年，它们是临床试验中最常用的工程化 NK 疗法来源（占试验的 43%），其次是 PB NK（21%）、iPSC（17%）和 CB NK（13%）。NK-92 细胞系源自 1994 年一名 50 岁男性非霍奇金淋巴瘤患者，由于表达 CD56 和许多主要 NK 激活受体，包括 NKp30、NKp46、2B4、NKG2D 和 CD28，被认为是类似 NK 的细胞系。相反，NK-92 细胞几乎缺乏所有的 KIR 受体，并且表达很少的抑制性受体（NKGA/B、低水平的 KIR2DL4、ILT-2），并且不表达负责 ADCC 的 CD16 受体。NK-92 细胞的强细胞毒性可以归因于这种受体表达谱，当激活时，它触发穿孔素-颗粒酶细胞毒性途径，以及由 FasL、TRAIL、肿瘤坏死因子样弱诱导凋亡因子（TWEAK）和 TNF-α 引导的死亡受体细胞毒性途径。为了克服 NK-92 细胞的局限性并朝着开发“现成” CAR-NK 细胞的方向迈进，已经开发了几个衍生细胞系。NK-92MI 被设计为产生 IL-2，从而不需要补充 IL-2。首个人体临床试验（NCT02944162）中，NK-92MI 表达 CD33 CAR 用于治疗复发和难治性急性髓系白血病（AML）患者，证明了这些细胞的临床安全谱。NK-92MI 细胞被慢病毒转导 CAR CD33.CD28.41BB.CD3z 构建体，扩增并在输注前共辐射（10 Gy）。在每个患者输注高达 5×10^9 个细胞后，未观察到显著的不良效应，尽管一名患者经历了 I 级 CRS。接受治疗的三名患者中，一名患者对治疗没有反应，而另外两名患者在 1 个月和 4 个月后复发。尽管这是一项小规模研究，患者数量有限，但它有助于证明 CAR-MI 细胞的积极安全谱，但治疗效果并不令人印象深刻。 NK-92细胞系的进一步优化产生了高亲和力NK-92（haNKs），这些细胞表达CD16受体，增加了抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性。目标亲和力NK-92（taNK）经过改造，能够针对特定的肿瘤细胞配体，此外，t-haNKs结合了所有这些特性，表达高亲和力CD16，分泌IL-2，并识别特定的肿瘤配体，如PD-L1。在II期QUILT 88试验（NCT04390399）之后，t-haNKs治疗典型难以治疗的胰腺癌的潜力得到了突出，该试验调查了ImmunityBio的Nant癌症疫苗，包括PD-L1靶向t-haNK细胞与IL-15受体激动剂Anktiva（N-803）、阿霉素、白蛋白修饰剂以及低剂量化疗在胰腺癌治疗中的组合。在联合治疗后，第三、第四和第五线患者的总生存期为5.8个月，几乎是历史生存期3个月的两倍，严重副作用不常见，为8%。随着许多关于CAR表达NK-92细胞的试验正在进行，调查使用包括CD19、MUC-1、HER2、ROBO1和PD-L1在内的一系列癌症靶标治疗血液和实体肿瘤，这些早期积极的结果可能预示着利用NK-92细胞的CAR-NK疗法的未来潜力。 KHYG-1细胞系已被证明比NK-92细胞具有更强的细胞毒性。这表明这个细胞系也可以作为“现成的”CAR-NK疗法的治疗应用，如Stikvoort等人的概念验证研究中所报告的。KHYG-1细胞通过逆转录病毒转导了含有CD28共刺激域的CD38-CAR，并产生了针对CD38high多发性骨髓瘤（MM）细胞系（UM9和THP-1）和来自患者的原发性MM细胞的有效CD38依赖性细胞毒性。此外，CD38-CAR KHYG-1细胞显著减缓了UM9肿瘤在具有人骨髓样生态位的RAG2–/–γc–/–小鼠异种移植模型中的生长。植入了表达荧光素酶的UM9 MM肿瘤的RAG2–/–γc–/–小鼠接受了多次静脉注射CD38-CAR KHYG-1细胞的治疗，治疗后20天，与未经治疗的对照组的24倍增长相比，CD38-CAR KHYG-1治疗小鼠的生物发光仅增加了四倍。这项研究突出了KHYG-1细胞被开发成类似于NK-92细胞的CAR-NK细胞的潜力，但需要进一步的研究来评估这在人类中的潜力，因为小鼠模型中的结果并不总是能够转化为人类。 从恶性来源衍生的NK细胞系在临床应用前需要进行辐射，这可能会影响其在体内的增殖和持久性。例如，NK-92细胞在体内的寿命很短，通常在初次输注后两天，这在减少副作用方面可能是有利的，与可以循环数月或数年的CAR-T疗法相比。然而，这种短暂的寿命可能导致较差的治疗结果和多次治疗的需求。已经对NK-92细胞进行了工程改造，以表达IL-2，增强体内扩增，但需要更复杂的工程来对抗TME中的NK耗竭，特别是对于实体肿瘤的治疗。KHYG-1细胞强烈表达抑制性受体NKG2A，当与MM细胞共培养时，发现其表达高水平的PD-1。这可能是CAR-NK疗法发展的一个主要障碍，需要在这些疗法成功之前加以解决。 4.2.NK细胞的CAR构建设计 最初的CAR-NK研究采用了旨在模仿T细胞受体的CAR-T骨干。然而，NK细胞毒性是由一组不同的激活和抑制受体调节的，这些受体可以并入CAR设计中，以激活天然NK受体并利用NK功能。CAR-NK细胞可以通过表达包含NK特异性跨膜信号域以及共刺激受体（例如，NKG2D、DNAM-1、2B4、CD28或4-1BB）的抗原特异性CAR分子来工程化，以优化NK细胞效应功能。这些设计旨在增强NK细胞在识别肿瘤抗原时的激活，并提高CAR-NK细胞的持久性、细胞毒性和细胞因子产生能力（图4）。 图4. 比较CAR-T和CAR-NK疗法中CAR构建设计元素的示意图。最初研究CAR-NK细胞时使用的构建与第三代CAR-T疗法中使用的构建相同，这些构建旨在模仿T细胞受体。此后，已开发出针对NK细胞的特定CAR构建，以纳入NK跨膜信号域以及共刺激受体（例如，DAP10、2B4、CD28或4-1BB），以增强NK细胞的效应功能。激活受体NKG2D也被纳入NK特异性CAR构建中；尽管NKG2D不是经典的“CAR”因为它不是单链可变片段（scFv），但在文献中它们被称为CAR。此图使用BioRender.com创建。 Li等人筛选了几种为NK细胞活动优化的CAR构建，包括各种跨膜和共刺激域的组合。比较了表达针对间皮素的CAR的iPSC-NK细胞（称为CAR-iPSC-NK），该CAR包含NKG2D跨膜域、2B4共刺激域和CD3ζ信号域，与基于T细胞的CAR包含两个CD28域与4-1BB（CD137）和CD3ζ（称为T-CAR-NK）在荧光素酶表达的A1847卵巢癌异种移植模型中的活性。与T-CAR-NK治疗组相比，CAR-iPSC-NK在生物发光成像后导致肿瘤负担显著减少并改善了生存期。此外，在与表达CAR的原代T细胞进行比较后，CAR-iPSC-NK组在70天时的生存期提高到80%，而T-CAR组为20%。重要的是，T-CAR组表现出严重副作用的证据，包括显著的体重减轻（>50%，在第23天和第39天各有2个n），严重的内脏出血和缺血，脾脏肿大以及对包括肝脏、肺、肾脏和肠道在内的内部器官的病理性损害的证据。相比之下，CAR-iPSC-NK治疗组没有观察到这样的效果。 我们知道NKG2D是一个主要的激活受体，负责在识别肿瘤细胞上表达的“杀伤我”压力信号，即MICA、MICB和UL16结合蛋白（ULBP-1和ULBP-6）后，引发caspase介导的凋亡。利用NKG2D可以增强NK细胞的抗肿瘤细胞毒性。Xiao等人报告了一项小型临床试验，研究PBMC衍生的NK细胞表达NKG2D与DAP12共刺激域融合，通过腹腔内（i.p.）输注给三名转移性结直肠癌患者（NCT03415100）。作者报告说，在两名患者中，腹水生成减少，腹水中的肿瘤细胞显著减少，而在第三名患者中，通过超声观察到肝脏区域的肿瘤迅速退缩，并通过PET-CT扫描确认完全的代谢反应。所有三名患者均报告病情稳定，重要的是，没有观察到剂量限制性毒性或GVHD。尽管这项研究中使用的CAR构建只有一种细胞内域的第一代设计，但它为进一步开发携带NKG2D受体的下一代CAR构建铺平了道路。这强调了精心设计的NK特异性CAR构建的重要性，以最大化CAR-NK治疗效应并减少与CAR-T构建相比的副作用，仍有相当数量的NK受体、共刺激域和每种组合需要探索。 4.3.CAR-NK制造的遗传改造方法 对于大规模生产“现成的”CAR-NK产品，用于遗传工程NK细胞的方法是一个重要的考虑因素，这可能影响生产时间、成本和可扩展性。理想情况下，用于创建CAR的转染方法应该是高效的、可扩展的，且非免疫原性的。目前，大多数CAR疗法是使用病毒载体工程化的，与非病毒方法相比，病毒载体产生稳定的基因表达和更高的转导率。NK细胞极难转导，特别是原发性PB和CB NK细胞，即使使用通常非常有效地转导广泛细胞的病毒载体；由于高表达免疫受体，如模式识别受体（PRRs），这些受体在病毒转导后触发NK细胞的凋亡。因此，通常用于CAR-T生产的遗传编辑的病毒载体，如水泡性口炎病毒G蛋白（VSV-G）慢病毒，在NK细胞中的转导率降低（<10%转导效率）。在VSV-G的情况下，这据说是由于NK细胞上低密度脂蛋白受体的低表达，这是VSV-G细胞进入所需的。 狒狒包膜假型慢病毒载体（BaEV-LV），它结合钠依赖性中性氨基酸转运蛋白（ASCT1和ASCT2）进行细胞进入，已被报道在新鲜分离的人NK细胞中产生23%的增强转导，并至少持续21天的稳定转基因表达。对于体外遗传工程，慢病毒载体的稳定表达是一个重要考虑因素，因为细胞被工程化以永久表达转基因，然后扩增后再输注给患者。然而，病毒载体有显著的缺点，包括关于突变、毒性、免疫原性的安全问题；昂贵且耗时的生产，除此之外还有漫长的NK细胞扩增协议；以及有限的核酸载体能力，这在传递更大的第三代、第四代和第五代CAR构建时可能是有问题的。例如，用于慢病毒生产的第二代CAR构建可能在10 kbp左右，随着后续几代中添加更多组件，这个数字会增加到20 kbp。因此，需要开发更安全、更高效的非病毒遗传改造方法用于CAR-NK生产。 5.基因编辑工具用于CAR-NK细胞 遗传编辑工具的发展，如DNA转座子和规律成簇短回文重复序列（CRISPR）技术，提供了一种稳定的转基因表达的非病毒方法。转座子系统是一类具有从一个位置移动或“转座”到基因组内另一个位置能力的遗传元素，通过“剪切和粘贴”机制，使它们成为遗传工程的强大工具。最有希望用于基因治疗的转座子是源自睡美人（SB）和猪儿虫（PB）系统。转座子系统由两个组成部分构成，转座子包含感兴趣的基因，通常以质粒形式存在，以及相应的转座酶酶，可能以蛋白质或编码转座酶蛋白的mRNA形式存在。转座子由特定的DNA序列包围，称为反向末端重复序列（ITRs），被转座酶识别。一旦识别ITR，转座酶就会切出转座子，然后将其插入新的基因组位置。尽管转座子系统有稳定的基因传递潜力，但由于担心意外的基因组中断或插入性突变和免疫原性导致难以获得监管批准，还没有转座子系统进入临床。最近，为SB系统开发的迷你圈载体的生产改进，这些载体具有最小的表达盒，缺乏细菌质粒骨架，有助于克服与质粒DNA载体相关的变量转染效率和宿主细胞毒性问题，与mRNA转座酶配对使用，有助于将转座子推向临床。BioTechne的TcBuster转座子系统是一个例子，它专门为CAR-T和CAR-NK生产而开发。它由一个含有基因表达盒的纳米质粒组成，与编码转座酶酶的mRNA配对。TcBuster成功地向原代人PB NK和T细胞传递了CD19-CAR构建，也表达了EGFP，产生的CAR表达NK和T细胞产生的细胞因子（IFNγ、TNFα和CD107a脱颗粒标记）显著多于CAR阴性对照，并且有效地杀死了目标CD19表达的Raji细胞。截至2023年11月，clinicaltrials.gov上注册了七项使用转座子系统的CAR-T细胞的临床试验，表明这项技术有可能应用于CAR-NK生产。 CRISPR是一类重复的DNA序列，与CRISPR相关（Cas）基因协同作用。CRISPR技术包括三个主要组成部分：crispr-RNA，与目标基因互补；Cas核酸酶蛋白，这是一种由crispr-RNA引导到DNA上特定位置的酶，像分子剪刀一样切割DNA；tracer-RNA有助于处理和绑定crispr-RNA和Cas核酸酶。CRISPR技术已被用来增强与原代NK细胞相比免疫功能较弱的NK-92细胞系的细胞毒性。使用针对CD96和KLRC1（编码NKG2A）的Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物通过核糖体电穿孔成功敲除抑制性CD96和NKG2A受体，结果只有2.8%的编辑NK-92细胞表达这些受体，而未编辑的亲本细胞为92.5%。此外，作者敲入了一个荧光mCherry基因，并替换了一个沉默的启动子，重新激活内源性CD16和DNAM-1。由此产生的CRISPR工程化NK-92细胞与未编辑的NK-92细胞相比显示出显著增强的细胞毒性，并且可以通过CD16介导的ADCC（抗体依赖性细胞介导的细胞毒性）对抗包括MDA-MB-231和BT-474乳腺癌细胞在内的一系列癌细胞。这项研究突出了CRISPR在工程化中利用各种NK激活和抑制受体以获得治疗效益的潜力。 转座子和CRISPR技术也可以同时使用，结合强大的遗传编辑活动。实际上，转座子工程和CRISPR/Cas9基因组编辑的结合被用来产生在PB NK细胞中表达髓样相关抗原CLL-1的强大CAR-NK细胞。TcBuster转座子系统传递了CLL-1 CAR构建，而CRISPR/Cas9载体被用来敲除NK细胞细胞因子检查点细胞因子诱导的含有SH2的蛋白（CIS，CISH基因的产物）。在CLL-1 CAR-NK细胞中同时敲除CISH与DNAM-1的减少和CD69表达的增加，NKG2D、NKp30、NKG2A、PD-1和TIGIT表达的减少有关。对控制和CLL-1 CAR-NK细胞都观察到增强的原发性AML芽细胞毒性，表明这些技术有潜力增强细胞毒性和改变NK细胞表型。同样，这种CISH敲除方法已在人类iPSC衍生的NK细胞和CB衍生的NK细胞中使用；导致增强的体内持久性、代谢健康和抗肿瘤活性。这些研究作为非病毒遗传编辑潜力的例子，但是NK激活和抑制受体之间平衡的复杂性需要进一步研究，以优化和利用这种治疗。 同样重要的是要承认围绕基因编辑工具存在安全性和伦理问题，包括转座子和CRISPR技术的风险，即插入性突变的风险。转座子基因组整合可能会激活潜在的原癌基因或中断肿瘤抑制基因，这可能导致恶性转化。尽管到目前为止SB转座子系统已经显示出良好的安全档案，但一项使用PB工程供体衍生的CD19 CAR-T细胞的临床试验导致10名患者中有2名发展出源自CD19-CAR-T细胞的T细胞淋巴瘤。尽管这项技术具有潜力，但在向临床进展之前，需要进一步的研究以确保转座子系统的安全性。包括避免可能增加原癌基因激活风险的强病毒增强子、使用“安全港”位点和位点特异性DNA结合域以实现位点特异性转座等策略，是克服转座子问题的潜在解决方案。在CRISPR的情况下，“非目标”DNA切割可能会引入不需要的突变，并可能加剧逆转录转位。减少非目标效应的方法包括优化CRISPR-Cas9系统的不同组成部分，开发主要编辑器和RNA编辑。尽管如此，在2023年11月，英国药品和保健产品监管机构（MHRA）成为第一个批准CRISPR-Cas9基因编辑疗法Casgevy（exagomglogene autotemcel）用于治疗输血依赖性β-地中海贫血和镰状细胞病的机构。这一里程碑式的批准在12月由FDA对Casgevy和Lyfgenia（lovotibeglogene autotemcel）以及欧洲药品管理局（EMA）对Casgevy的批准跟进。尽管接受Casgevy和Lyfgenia治疗的患者仍在进行这些治疗的安全性和有效性的长期评估，但这一批准无疑将为CRISPR基因组编辑技术的进一步使用和批准打开大门。 图5. 非病毒基因工程化“现成”CAR-NK细胞需要高效转染和CAR转基因的稳定表达。 1.引入编码DNA和/或mRNA中的CAR结构的CAR构建，或使用CRISPR Cas9或DNA转座子技术如PiggyBac和Sleeping Beauty进行基因编辑，以实现稳定的基因表达。2. 编码CAR构建的核酸可以通过多种非病毒递送策略传递给NK细胞，包括电穿孔、脂质纳米颗粒、细胞穿透肽或多功能纳米颗粒。3. 转染后，表达CAR构建的NK细胞在体外扩增，以生产可用于治疗多个患者的“现成”CAR-NK产品。 6.向NK细胞的非病毒基因传递 尽管非病毒基因组编辑方法具有巨大的潜力，但一个主要障碍是细胞内传递的方法。总的来说，转座子和CRISPR技术由核酸组成，无论是DNA还是RNA形式，因此需要一种细胞进入的方法。一般来说，最常用的非病毒传递方法通过物理电穿孔裸核酸，或涉及与脂质体、阳离子聚合物、蛋白质或细胞穿透肽（CPPs）的复合物的化学方法，这些复合物包装核酸并促进细胞内传递，在图5中总结。尽管在其他细胞类型中取得了成功，但与病毒转导相比，NK细胞更难转染，非病毒转染率令人失望。对于体外基因传递，基因传递的主要障碍是细胞膜、内体陷困，在DNA的情况下，是进入细胞核，为了成功的基因传递，理想的传递载体必须克服这些障碍，同时无毒。电穿孔（包括核糖体电穿孔）是用于NK细胞非病毒传递的最广泛使用的方法，转染效率高达90%，但由于对细胞施加的强电场可能导致问题，可能会增加制造时间表和成本。在电穿孔传递质粒编码报告基因绿色荧光蛋白（GFP）时，原代NK细胞的细胞存活率报告低至2%，尽管通过仔细优化提高到50%，一些电穿孔器制造商引用的存活率为80-90%。尽管如此，这些方法需要仔细优化，使用细胞因子刺激或与饲养细胞一起扩增以获得足够的转染效率和存活率。少数研究使用非病毒传递系统作为NK细胞基因传递的方法（在表3中总结），取得了不同程度的成功。 6.1.基于脂质的NK细胞递送 脂质在脂质体和脂质纳米颗粒（LNP）中被用来递送核酸，用于多种应用，包括最重要的，使用脂质纳米颗粒递送mRNA新冠疫苗，由BioNTech和Moderna两家公司开发。这些基于LNP的疫苗的批准代表了非病毒递送系统领域的一个重大突破，并为后续产品铺平了道路。脂质是含有极性头基团与疏水尾部相连的两亲分子，具有一系列属性的脂质已被用于基因递送。阳离子脂质，如1,2-二-O-十八烷基-3-三甲基铵丙烷（DOTMA）及其衍生物1,2-二油酰-3-三甲基铵丙烷（DOTAP）允许包装遗传货物并通过静电相互作用和膜融合进行细胞内递送。在生理pH值下呈中性的可电离脂质，在内体的低pH值下变得质子化，促进内体释放货物。其他脂质，如1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷脂胆碱（DSPC）和胆固醇类似物已被用来帮助稳定LNP结构。LNPs可能通过各种内吞途径被内化，如巨胞饮作用、网格蛋白介导的和洞穴蛋白介导的内吞作用，这在不同细胞类型之间有所不同。内化后，LNPs通常进入内体隔室，需要一种逃逸机制来释放货物。因此，通常使用具有不同属性的脂质组合来优化LNP功能。Nakamura等人开发了一种多功能信封型纳米装置（MEND），其中包含一种可电离-阳离子脂质，以促进内体逃逸，称为YSK12-C4脂质（YSK12-MEND），用于递送siRNA到免疫细胞系。作者证明了YSK12-MEND在一系列人类免疫细胞中递送编码GAPDH的siRNA的转染能力。在NK-92细胞中的基因沉默为75%，远高于商业上可用的Lipofectamine RNAiMAX的19%沉默。然而，YSK12-MEND LNP在NK-92细胞中引起了细胞毒性（在30 nM siRNA剂量下60%的细胞存活率）。该团队最近生产了由pH敏感阳离子脂质CL1H6组成的LNP，用于siRNA递送到NK细胞系。CL1H6具有与YSK12-MEND相同的亲水头基团和油酸结构作为疏水尾部，用氨基取代了甲基基团，这促进了NK-92细胞通过膜融合的细胞摄取和内体逃逸。CL1H6与LNP中的胆固醇的比例被优化为25/75，以获得更好的基因沉默效果（在递送针对GAPDH的siRNA后，GAPDH的基因沉默为90%），同时保持NK-92细胞中的良好细胞存活率（90%存活率）。对于KHYG-1细胞也报告了类似的结果。作者将这种改善的细胞存活率归因于内体逃逸期间的膜融合活性。YSK12-MEND以高度的膜融合从内体逃逸，而CL1H6-LNP仅以轻微的膜融合从内体逃逸。同样，Doukas等人最近优化了LNP配方，用于mRNA递送到NK细胞，使用可电离脂质。优化的LNP由可电离的“Lipid 5”，DSPC，β-谷甾醇和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000（DMG-PEG2K）组成，在KHYG-1细胞系中产生了>80%的转染效率，在CB衍生的NK细胞中为75%，每种细胞类型的细胞存活率都>95%。Wilk等人提出了使用电荷改变可释放转运体（CARTs）将基因递送到NK细胞。CARTs是由≥1个脂质块和为mRNA递送设计的电荷改变块组成的多块寡聚体。CARTs最初是阳离子，可以与阴离子核酸复合，但在生理条件下（pH7.4）生物降解为中性二酮哌嗪小分子，促进阴离子货物的释放。在用CART递送31 ng mRNA编码GFP到PB NK细胞后，32%的细胞表达了GFP，细胞存活率为78%，这明显优于Lipofectamine 2000（0% GFP+细胞，90%存活率）和电穿孔（2% GFP+细胞，40%存活率）（注：当通过电穿孔递送的mRNA质量增加到10 μg时，转染效率提高到28% GFP+细胞，存活率为40%）。此外，CART成功产生了CD19-CAR-NK细胞，这些细胞对CD19+ Nalm6细胞具有强大的细胞毒性，死亡目标细胞比例为10%，而原始NK细胞为5%。这表明CARTs作为一种非病毒系统用于CAR-NK生成的潜力，但瞬时mRNA递送可能对体内CAR-NK细胞的扩增和效力构成问题。需要进一步的研究来扩大这种方法用于更大的体内研究，评估体内CART产生的CAR-NK细胞的寿命，并与病毒转导的CAR-NK细胞的效力进行比较。 6.2.多功能纳米颗粒用于NK细胞递送 Kim等人描述了一种由磁性Zn/Fe核、咖啡酸封顶以及表面涂覆阳离子多巴胺聚合物组成的多功能纳米颗粒（MFNPs），这些纳米颗粒与阴离子核酸形成复合物，用于向NK-92MI细胞递送CAR。磁性核使NK细胞的磁共振成像成为可能，并促进体内细胞追踪。通过MF-NPs向NK-92MI细胞递送编码表皮生长因子受体（EGFR）CAR结构的质粒，转染效率为60%，细胞存活率为98%。将EGFR-CAR-NK-92MI细胞通过尾静脉注射到无NK细胞的NOG小鼠（NOD/Shi-scid/IL2Rγnull）体内，这些小鼠携带MDA-MB-231异种移植物，与接受原始NK-92MI和PBS对照处理的小鼠相比，CAR-NK-92MI组的肿瘤生长明显减少（与原始NK-92MI和PBS对照相比，肿瘤大小分别减少了两倍和3.5倍）。进一步的工作将需要评估基于磁性NPs的生物相容性和降解特性，并确保MF-NP编辑的CAR-NK细胞在临床应用中有足够的扩增和持久性。 6.3.基于肽的NK细胞递送 基于肽的载体因生物相容性、灵活性和低毒性等优势而受到基因递送的关注。从病毒中衍生或设计模仿病毒载体序列的肽具有广泛的特定功能，使基因递送成为可能并得到增强，通常根据功能分类；DNA凝聚肽、细胞穿透肽（CPPs）、内体溶肽和核定位序列（NLS）。CPPs是短肽（5-30个氨基酸），它们有效地携带大分子货物穿过细胞膜，无需受体或其他载体。开发了一种肽辅助基因组编辑（PAGE）CRISPR-Cas系统，该系统利用CPP和内体逃逸肽在髓系细胞、原代T细胞和NK-92细胞中进行基因组编辑。设计了一种细胞穿透Cas9，由N端融合HIV TAT（GRKKRRQRRR）和4×Myc NLS，C端融合2×SV40 NLS和GFP。然后，这种细胞穿透Cas9与一个“辅助肽”共递送；融合肽（称为TAT-HA2（RRRQRRKKRGGDIMGEWGNEIFGAIAGFLG））由源自HIV-1的CPP TAT肽和流感A病毒血凝素（HA2）蛋白的内体逃逸肽组成。TAT-HA2辅助肽在mCherry+ EL4 T淋巴母细胞报告细胞中增强了Cas9编辑，效率从无法检测提高到85%，细胞存活率超过80%。此外，PAGE系统在NK-92细胞系中实现了78%的基因编辑，突出了CPPs在NK细胞基因编辑中的潜力。然而，这是一种复杂的工程策略，如果要递送CAR结构，将需要更多的开发。 7.NK细胞基因递送的特定挑战 目前非病毒转染NK细胞的困难因对这些高度专业化细胞中特定生物学障碍的理解不足而更加复杂，设计针对NK细胞治疗的非病毒递送系统时必须考虑NK细胞特有的元素。细胞摄取是基因递送的第一个生物学障碍，而具有专门激活和抑制受体的NK细胞比大多数细胞类型更为复杂。在细胞内摄取之后，内体逃逸是成功基因递送的第一个障碍。考虑NK细胞的特殊溶解机制很重要，以避免遗传货物在内体/溶酶体隔室中降解。此外，NK细胞通过模式识别受体（PRR）信号传导的先天免疫活性，促进了NK细胞的抗病毒活性，被认为是NK细胞对病毒载体的抵抗力，非病毒载体必须设计得避免同样的命运。克服这些NK特定的基因递送障碍对于非病毒基因递送系统在NK细胞治疗中取得成功至关重要。 7.1.NK细胞的细胞内递送 内吞作用被认为是大多数非病毒基因递送系统的主要摄取途径，可以分为网格蛋白介导、洞穴蛋白介导或微囊泡形成。摄取可能受到递送系统的性质和细胞类型等因素影响。在NK细胞的情况下，激活和抑制受体的平衡由受体的内吞作用和再循环到细胞表面来调节。例如，抑制性受体CD94/NKG2在细胞表面和细胞内隔室之间不断循环，这一过程类似于巨胞饮作用。流感病毒通过网格蛋白和洞穴蛋白依赖性内吞作用直接感染PBMC-NK细胞。感染是通过病毒HA蛋白与NK细胞表面存在的α-2,3和/或α-2,6连接的末端唾液酸的结合而发生的，特别是在激活性受体NKp46上。NKp46与病毒感染细胞表面的HA的相互作用是NK细胞识别和杀死感染靶细胞的已知机制，但看来病毒本身也可以通过与NKp46的相互作用感染NK细胞，这导致感染的NK细胞凋亡增加，NK细胞毒性活性降低。这些关于病毒感染方法的知识可能被利用来设计非病毒递送系统，就目标或避免特定摄取途径以增强基因递送而言，而不会引起不希望的激活导致NK细胞内表型变化。 阳离子递送系统，特别是富含精氨酸的肽，已知会通过静电作用结合细胞膜外表面存在的阴离子物种（例如脂质头基、肝素硫酸蛋白聚糖（HSPGs）和细胞膜上的syndecans），启动细胞摄取。Letoha等人报告称，syndecans促进阳离子CPPs（例如，TAT）的摄取。该研究表明，syndecan-4特别结合并介导阳离子CPPs通过质膜进入K562红细胞白血病细胞，更高的syndecan-4水平与更高的转染效率相关。根据细胞分化的不同阶段和细胞类型，syndecans上存在的肝素硫酸链的数量和大小各不相同。因此，不同细胞表达的syndecans可能导致不同的转染结果。HSPGs和syndecans由NK细胞表达，并已报告与激活性NCRs（NKp30、NKp44和NKp46）和KIR2DL4（抑制性受体）相互作用并调节其功能。这些受体可以识别并结合HSPG，这些HSPG通常在靶细胞（例如癌细胞）中上调，但它们也可能与NK细胞表面的HSPG结合；通过掩盖与靶细胞的相互作用或可能影响NCRs的内吞作用、降解和再循环途径，影响NK受体的功能。如果递送系统结合HSPG或syndecans进行内吞作用，可能会触发不希望的NCRs激活；影响NK细胞的激活状态或触发凋亡。因此，需要仔细设计以获得最佳的转染效率，而不扰乱NK受体状态。 受体介导的内吞作用通常被用来增强基因递送系统的转染，而主动靶向策略可能有助于克服与HSPG相关内吞作用的问题。同样，从病毒载体中获取灵感，当确定适合受体介导的内吞作用的靶标时。例如，BaEV慢病毒转导是通过与新鲜分离的人类NK细胞中的ASCT1和ASCT2结合来介导的，这可能被非病毒递送系统所针对。 7.2.NK细胞的内体逃逸 非病毒递送系统被设计为通过“质子海绵”效应或对内体中低pH值的融合活性来促进内体逃逸。然而，内体隔室的确切pH值可能因细胞类型而异，细胞系和原代细胞之间存在差异，内体中的具体功能或货物内容也会影响。在设计基因递送系统方面，关于NK细胞内体pH的文献资料很少。我们可以比较其他免疫效应细胞，如T细胞和巨噬细胞，以了解免疫细胞内体的特性，但这不能代替对NK细胞的专门评估。内体酸化在人类Jurkat T细胞中被报道比常用的评估阳离子聚合物基因递送的HeLa人类细胞系慢且不如其稳健（在摄取后240分钟内从pH 6缓慢下降至pH 5.2），而HeLa细胞系在摄取后120分钟内pH值下降至5.0，原代T细胞显示出更高的内体pH（>pH 6）。也有报道称巨噬细胞的早期内体和循环内体具有中性pH，这促进了瞬时受体电位muclipin 2（TRPML2）的活性；TRPML2是位于溶酶体隔室的钙通透阳离子通道，参与质膜蛋白的循环。TRPML2也在CD57+ NKG2C+ NK细胞中表达，被推测涉及调节激活NK细胞中的趋化因子分泌。因此，可以推断NK细胞中的内体也可能在早期内体隔室中具有更高的pH（pH>6），但需要研究来确认这一点。考虑到NK细胞的细胞毒性主要通过含有穿孔素和颗粒酶的专门分泌溶酶体或溶解颗粒来执行，因此这种溶酶体机制的存在可能会影响转染后的内体运输和逃逸。如果NK细胞的内体pH接近中性，如T细胞和巨噬细胞一样，那么这可能对需要更低pH值来触发内体逃逸的递送系统构成问题，需要进一步调查以优化针对NK细胞的递送系统设计。 7.3.避免NK细胞中的模式识别受体（PRR）激活 在感染期间，NK细胞通过PRR检测病毒或细菌病原体相关分子模式（PAMPs）的存在，PRR是NK细胞介导的先天免疫反应的重要组成部分。NK细胞表达多种PRR，包括Toll样受体（TLR）1-10、RIG1、NOD2和MDA5，这些在激活时参与诱导细胞毒性。TLR3、7、8在内体中表达并检测双链RNA（TLR3）、单链RNA（TLR7和8）和CpG DNA（TLR9）。这种核酸感应有助于病毒检测和抗病毒免疫反应。这样的PRR被认为是NK对基于病毒的转导产生抵抗力的原因之一。实际上，抑制PRR活性可以增加NK细胞中VSV-G假型慢病毒载体的转导效率。作者用BX795，一种TBK1/IKKe复合体的抑制剂，该复合体作用于PRRs RIG-I、MDA5和TLR3的下游，预处理新鲜分离的PB NK细胞，结果使慢病毒转导效率增加了3.8倍。在NK-92细胞系中也观察到在BX795存在下转导显著增强。 因此，PRR的核酸感应是NK细胞基因递送的一个障碍。mRNA或DNA货物的递送可能会激活PRRs，触发抗病毒NK过程，导致转染NK细胞的存活率差。可能可以利用修饰的mRNA来避免NK细胞中的PRR识别。核苷替换已被证明在减少PRR检测和改善mRNA翻译方面具有显著意义。常见的修饰包括用类似核苷如假尿嘧啶（ψ）或N-1-甲基-假尿嘧啶（m1ψ）替换尿嘧啶，以及用5-甲基胞嘧啶替换胞嘧啶。在“基于脂质的NK细胞递送”一节中讨论的研究包括两个使用修饰mRNA递送到NK细胞的例子。Doukas等人用LNPs递送了5-甲氧基尿嘧啶（5moU）修饰的mRNA，而McKinlay等人递送了5-甲基胞嘧啶修饰的mRNA。两项研究都没有评论他们选择使用修饰mRNA的决定或选择特定修饰的原因。在mRNA疫苗领域，尤其是假尿嘧啶修饰的mRNA产生了更好的翻译，归因于减少了与RNA依赖蛋白激酶的结合。然而，需要进一步的研究来确定CAR递送到NK细胞的最佳核苷修饰。 如果要递送基于DNA的货物，例如在转座子系统中，那么应该考虑限制CpG含量。在CAR结构递送的背景下，这一点尤其重要，考虑到要递送的CAR构建物的较大尺寸。DNA迷你圈技术已被用于SB转座子系统，以帮助减小货物大小并提高转染效率。TcBuster系统使用了专门针对T和NK细胞CAR结构递送设计的“纳米质粒”技术。 8.结论和未来方向 总之，这篇综述详细分析了当前CAR-NK疗法和非病毒工程化NK细胞的状态，强调了CAR-NK作为一种有前景的癌症免疫治疗方法的潜力，以及实现这一潜力需要克服的挑战。CAR-NK疗法的使用仍处于早期阶段，但在多种癌症类型的前临床和早期临床试验中已显示出强大的抗肿瘤活性。增强的安全档案和更可扩展、成本效益更高的“现成”CAR-NK疗法的潜力将增加患者的可及性；改善患者的治疗结果和生活质量。需要开发针对NK细胞的高效非病毒工程策略，以改善CAR-NK疗法的制造过程，以支持对先进疗法日益增长的需求。到目前为止，理想的非病毒递送系统尚未开发出来，该系统能够高效地将CAR转基因递送到NK细胞中，而不会影响细胞的活性或受体状态；考虑到受体状态对NK细胞功能的重要性。有必要进一步研究新的递送系统和临床试验，以充分释放CAR-NK细胞的治疗潜力，并将这些发现转化为常规临床实践。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

IVC2024第四届核酸疫苗与创新型疫苗论坛议程曝光点击图片查看，大会火热进行中，明天继续：（扫码立即领取限量免费参会入场券）疫苗的定义疫苗是将病原微生物(如细菌、病毒等)及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。疫苗保留了病原菌刺激动物体免疫系统的特性。当动物体接触到这种不具伤害力的病原菌后，免疫系统便会产生一定的保护物质，如免疫激素、活性生理物质、特殊抗体等;当动物再次接触到这种病原菌时，动物体的免疫系统便会依循其原有的记忆，制造更多的保护物质来阻止病原菌的伤害。国内传染病发病情况2017年，甲乙类传染病发病率222.1/10万，死亡率1.4/10万。发病数前5位的病种依次为病毒性肝炎、肺结核、梅毒、淋病、细菌性和阿米巴性痢疾，占甲乙类传染病发病总数的92.8%；死亡数前5位的病种依次为艾滋病、肺结核、病毒性肝炎、狂犬病、人感染H7N9禽流感，占甲乙类传染病报告死亡总数的98.8%。2017年，丙类传染病发病率287.5/10万,死亡率0.01/10万。发病数前5位的病种依次为手足口病、其他感染性腹泻病、流行性感冒、流行性腮腺炎和急性出血性结膜炎，占丙类传染病发病总数的99.8%；死亡数较多的病种依次为手足口病、流行性感冒和其他感染性腹泻病，占丙类传染病报告死亡总数的100％。疫苗的免疫反应疫苗的分类我国疫苗主要分为一类疫苗和二类疫苗。北京市第一类疫苗（2014-2016年）15种A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗、A群脑膜炎球菌多糖疫苗、冻干水痘减毒活疫苗（应急接种用）、脊髓灰质炎减毒活疫苗糖丸、脊髓灰质炎灭活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、流感病毒裂解疫苗（老人和学生用）、麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗、麻疹风疹联合减毒活疫苗、麻疹减毒活疫苗、吸附白喉破伤风联合疫苗、吸附无细胞百日咳白喉破伤风联合疫苗、乙型脑炎减毒活疫苗、重组乙型肝炎疫苗、双价肾综合征出血热疫苗（应急接种用）北京市第二类疫苗（2016年）19种23价肺炎球菌多糖疫苗、A、C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗、ACYW135群脑膜炎球菌多糖疫苗、b型流感嗜血杆菌结合疫苗、冻干人用狂犬病疫苗、冻干水痘减毒活疫苗、脊髓灰质炎灭活疫苗、甲型肝炎灭活疫苗、甲型乙型肝炎联合疫苗、口服轮状病毒活疫苗、狂犬免疫球蛋白、流感病毒裂解疫苗、麻疹腮腺炎风疹联合减毒活疫苗、森林脑炎灭活疫苗（专业人员用）、无细胞百白破b型流感嗜血杆菌联合疫苗、吸附无细胞百白破灭活脊髓灰质炎和b型、流感嗜血杆菌（结合）联合疫苗、乙型脑炎灭活疫苗、重组B亚单位/菌体霍乱疫苗、重组乙型肝炎疫苗国内疫苗市场仍由一类疫苗为主导，由国家财政拨款购买，集中采购，下游需求比较稳定。二类疫苗市场主要由民营企业主导，毛利高、市场化竞争程度高。民营企业占比60%左右、国企占比在30%左右、外企占比在10%左右。一类疫苗与二类疫苗的批签发量比例约为：3：2疫苗新规国家规定2019年12月1日开始施行《中华人民共和国疫苗管理法》；疫苗法的实施，会带来哪些机会呢？在《疫苗管理法》中，有几点内容值得重点关注。疫苗上市流程疫苗生产流程疫苗生产原料是生物体，类似生物药，生产过程中难以控制变异可能；质量控制严格，要求10000级洁净室，100000级洁净室；疫苗主要针对健康人群及婴幼儿，因此疫苗的安全性、有效性、可控性、一致性要求比一般药品还要高。疫苗行业产业链疫苗行业的上游一般包括临床、流行病研究机构、基础研究机构或企业，还包括参与疫苗研发、生产的设备、培养基、化学试剂和药包材等制造企业疫苗行业的下游为符合国家相关法规的合格经销商、代理商，实施疾病预防和控制工作的各级疾控中心、医院、接种点最终端为普通消费者上市前的质量控制手段——批签发制度流通制度——一票制疫苗行业上游-疫苗供应主力军我国官方的疫苗生产历史从1919年北洋政府中央防疫处的建立开始；新中国成立后，国家分别在北京、上海、武汉、长春、兰州、成都、昆明成立生物制品研究所；2017年，七大所占据了国内疫苗批签发量的52%疫苗行业中游-疫苗的流通一类疫苗属于国家强制接种，由政府在省级平台统一采购，由生产企业直接配送至终端CDC。二类疫苗的采购在疫苗新规之后，纳入省级集中招标平台，生产企业只能通过省级交易平台将疫苗销售给县疾控中心,同时需要直接或者委托配送，配送环节要求全程冷链运输，疫苗流通全部实现一票制。疫苗行业下游-疫苗接种及接种群体2017年，专业公共卫生机构中，疾病预防控制中心3457个，总的机构人员数为19.1万人，其中：省级31个、市(地)级412个、县(区、县级市)级2773个。二类疫苗不属于强免范围，可自愿选择打或不打。凡是收费的疫苗都需要签名认可，方可接种。疫苗行业发展的驱动力驱动力一：疫苗品种驱动力二：接种人数疫苗行业特点特点一：疫苗行业无论从全球市场还是公司角度都是品种驱动型，都具有上市时的起步销售额较大（起步都在2亿美金以上）、年均复合增速在7%-10%的特点。疫苗技术代际的大跨越需要多学科的发展和支持，一般需要30-40年左右的时间完成积累，同一品类疫苗的再次创新和技术升级需要10-15年的时间，因此疫苗市场的竞争格局相对稳定新的重磅炸弹都是从技术和工艺积累颇深的企业里孕育而生。因此，疫苗行业具有较高的准入门槛和技术壁垒。超级重磅品种推动或是持续不断的多品类推陈出新，造就了辉瑞或GSK的巨头地位。特点二：特点三：疫苗品种规模的大小具有DT和ET的特点，即Disease Talks & Effectiveness Talks，发病率决定了赛道的宽度，效果（技术和工艺）决定了赛道的高度。发病率越高且疾病进展危害越大的疾病其疫苗市场规模也越大；疫苗保护率不能超过现有疫苗或保护率提升不明显，都不能成为真正的重磅品种。各疾病发病特点的差异，决定了疫苗市场的结构趋于“积木式”，而工艺和技术的积累又具有连续性，因而大品种只会从积累深厚的企业中诞生。疫苗与创新药现金流模式的差异经疫苗的消费属性不同于药品，大部分疫苗完成接种后不存在再次接种的必要，而一些重磅药品需要终生服药，因此药品对价格的敏感度会更高，随着价格下降其渗透率会提升、产品生命周期会延长。重磅疫苗不仅起始销售额远高于药品，而且会在上市早期纳入部分国家的计划免疫体系内，在10-15年内迅速达到销售峰值，直至新一代的疫苗出现，其销售额会快速回落，其疫苗的产品替代性较药品更加明显。对于测算若干年后某疫苗市场规模最关键的变量为渗透率，而渗透率的决定因素为是否纳入计划免疫范围、疾病的危害性和疫苗的有效性。全球疫苗市场格局全球疫苗市场高度集中。近年来，四大疫苗巨头（葛兰素史克、赛诺菲、默沙东、辉瑞）合计销售额占比维持在全球市场总额的80%以上。全球疫苗市场规模前瞻研究院数据预测：2018年全球疫苗市场规模约494亿美元。受全球对疫苗接种日益增加的需求、政府及国际机构的支持以及研发新疫苗的驱动，预计全球疫苗市场规模将于2030年达到1000亿美元，年复合增速为6.6％。中国疫苗行业现状国内疫苗行业同样有高准入、高投入、高周期、高收益、高毛利特征，是典型的“五高”行业。高准入壁垒、高研发投入和长耗时、生产的周期性，共同导致了行业的高成本，抬高了整个行业的门槛。我国疫苗市场目前整体规模偏小，2017年，国内疫苗市场规模达到250亿，占全球438亿美元的市场总额较小（8%），远小于我国人口占世界人口的比例（18%）近几年没有重磅产品出现，行业增长较慢，急需有重磅品种冲击市场。中国疫苗市场规模2017年中国疫苗市场规模253亿元，2013-2017年CAGR为6.2%其中，一类苗市场37亿，2013-2017年CAGR为-16.3%二类苗市场217亿，2013-2017年CAGR为14.9%灼识咨询预测：2030年我国疫苗市场规模1009亿元，CAGR为11.2%其中，一类苗市场33亿，2018-2030年CAGR为-0.8%二类苗市场976亿，2018-2030年CAGR为12.3%中国疫苗行业总结中国疫苗行业发展前景一类疫苗发展前景整体上看，国内规划免疫计划下的国家采购行为决定了一类苗的市场空间弹性有限。二类疫苗发展前景二类苗为可选消费品，其属性决定了产品的升级和丰富能够刺激市场的扩大，支付能力和更多的需求反过来促进品种的升级。目前，二类苗的竞争力一方面是安全性、顺应性上对传统一类苗的升级替代；另外是满足未被一类苗覆盖的新疾病领域。联合疫苗、多价苗、新型疫苗，这将是未来疫苗行业发展的重要方向。中国疫苗行业投资趋势一类疫苗投资空间一类疫苗由国家统一控制，免费供应，国家定价、政府招标采购的模式，定价低、毛利低。所以一类疫苗基本上处于垄断竞争的微利状态。一类苗基本由国企垄断，受制政策导向严重，市场化程度极低，基本不存在可预见的投资空间。二类疫苗投资空间国内二类疫苗赚钱能力极强，但由于疫苗属于国家管制商品，受限于政策，并不是完全由市场把控。二类苗行业竞争激烈，疫苗企业的销售费用均占到营收40%以上，国内疫苗企业在销售费率上有增无减。外资企业技术成熟、资金雄厚，品种多样性；国内二类疫苗竞争上优势不明显。只有自身技术过硬、销售能力强、资本雄厚的公司才会有机会成为中国的疫苗寡头。疫苗行业投资逻辑“短期看品种”，无论是整体疫苗市场还是公司的收入结构，都具有品种导向性，站在当下或面对未来，欲打造中国的“GPSM”需要有重磅品种面世或储备才具备持续成长性。监管趋严会使得市场集中度提高、“二八原则”也将在中国市场突显，强者恒强的逻辑将逐渐得到验证。“长期看工艺和技术”，具备产能和规模优势的企业，且工艺、技术持续积累的企业才有可能孕育新的品种，兼顾质控与创新。由于技术和工艺的延续性，除了看现有和即将上市的品种，从专利角度即可大致判断生产企业对于未来品种的储备和工艺积累的完成度。疫苗上市公司-智飞生物重庆智飞生物成立于1995年，2010年在深交所上市，是我国第一家在创业板上市的民营疫苗企业。主营业务为疫苗、生物制品的研发、生产、销售、推广、配送以及进口疫苗的代理销售等。智飞生物以代理疫苗起家，直销比例维持在 70%-80%。公司销售人员合计1792人，典型销售型企业。2007年开始，智飞生物自主研发的产品陆续上市，公司从疫苗代理企业逐渐转型为代理和自主研发同步发展的企业。股权结构男，1953年出生，桂林医学院大专学历，副主任医师，中国国籍；曾任广西灌阳县卫生防疫站副站长、广西计划免疫科、生物制品管理科科长、总经理等职务，现任智飞生物董事长、总经理，重庆市江北区人大代表。财务表现公司AC-Hib疫苗步入高速放量期，代理产品四价、九价HPV疫苗销售态势非常良好，五价口服轮状病毒疫苗获批，微卡报产，将与EC诊断试剂盒形成肺结核“诊断筛查+预防+治疗”全产品链布局，企业未来前景广阔。自研及代理产品核心产品——AC-Hib三联疫苗（自研）多联苗替代单苗的趋势势不可挡，替代效应逐渐显现。AC结合疫苗和Hib疫苗批签发量逐渐下降。AC-Hib三联苗于2014年上市，2015年正式销售，2018年销量约640万支，收入10亿元左右。财务预测：根据太平洋证券研究院预测，按照现有市场及替代效率，符合增长率25%计算，预计2022年AC-Hib三联苗销售将达到峰值，即1000万支，收入21亿人民币，贡献10亿净利润。需要注意！！！公司AC-Hib 疫苗于 2014 年 4 月 2 日获得原国家食品药品监督管理总局的药品注册批件（批件号：2014S00240），批准该产品注册，并颁发了药品批准文号（国药准字 S20140003），批准文号有效期5年。而2019年4月1日正是有效到期日。截止目前，公司还未拿到再注册批件，该产品从4月份开始已停产，目前无任何准确消息。核心产品——HPV疫苗（代理）人乳头状瘤病毒（HPV）是一种男女均可能感染的通过性传播、皮肤密切接触传播病毒，临床证明，99.7%的宫颈癌都是 HPV 感染所引起，不仅如此，85-90%的肛门癌、70-75%的阴道癌、30%的 外阴癌也与 HPV 感染密切相关目前，全球共有3种HPV疫苗。据智库推算，预计2020年我国HPV疫苗市场超过300亿。2017年5月，智飞获得默沙东的四价疫苗的独家代理销售权，2018年5月，获得默沙东的九价疫苗的独家代理销售权。公告显示，双方协议约定的 HPV 疫苗综合基础采购额为：2019年55.07亿元、2020年83.3亿元、2021年（6月30日前）41.65亿元。简单计算即可得出，未来3年，智飞生物从默沙东采购的HPV疫苗金额将达到180.02亿元。这也就是说，智飞生物的主营业务收入3年间，仅HPV基础采购就足以贡献180亿元营收，毛利近90亿元（50%的毛利率），净利润在50亿左右（净利润率28%），每年17亿，每股多增加1.4元的业绩，即便按照30倍的市盈率，新增股价近42元，接近翻倍。假设一：由于 GSK 批准的年龄段为 9~25 岁，且由于其产品为 2 价，我们认为其未来占比会很低，故暂不考虑2价疫苗的市场假设二：到 2023 年，5年左右时间存量，3亿左右的适龄人群累计接种率提高到10%（已知：我国HPV适龄人群免疫覆盖率约1%，远低于发达国家的60%-80%）假设三：5年时间内，国内外暂无可替代产品或者优化产品出现财务预测：默沙东HPV疫苗2019~2023 年销售量分别为 880 万支、1350 万支、1800 万支、2100 万支、2300 万支，4 价和 9 价 HPV 价格分别为 798 元/支和 1298 元/支，按照平均价1000元测算，则2019年~2023年HPV销售额分别为88亿、135亿、180亿、210亿和230亿元。其他重点产品——五价轮状疫苗人类轮状病毒(HRV)是导致全球儿童急性重症腹泻的主要原因，每年约有52.5万名五岁以下儿童死于腹泻病；全球90%的人类轮状病毒感染来源于G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]和G9P[8]五种病毒株，G1P[8]型最常见。市场情况：国内上市疫苗有两种，一是默沙东的五价轮状病毒疫苗RotaTeq，一是我国兰州的单价轮状病毒疫苗罗威特；智飞生物获得默沙东口服五价轮状病毒疫苗的独家代理权五价轮状疫苗作为远优于已有疫苗的品种，能迅速替代已有疫苗（已有疫苗销售近10亿）预测：未来2-3年内，疫苗每年贡献收入超20亿在研管线及进度在研重磅产品-母牛分枝杆菌疫苗结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，可侵及许多脏器，80%发生在肺部，是全球前10位死因之一；市场情况：对于预防结核病市场尚无有效的疫苗，已有的卡介苗只对儿童重症结核病和严重肺外结核病具有保护作用，不能预防原发性感染 (首次感染结核杆菌)，更重要的是不能预防肺部潜伏感染(隐性感染)；2018年4月，智飞的母牛分枝杆菌疫苗(结核感染人群用)申请新药生产注册获得受理，并于2018年6月正式纳入优先审评。8部门联合印发《遏制结核病行动计划(2019—2022 年)》假设一：按照1500万新生儿数量测算，则对应小学、初中、高中、大学(本科+研究生) 新生入学人数在 5300万左右；假设二：到2023年覆盖新生入学人数为20%，即1060万人，结核杆菌感染率 18%的比例，即筛查出结核杆菌携带者191万人，假设接种率60%；假设三：按照目前的6 支/人份，300元/支；预测：未来2-3年内，结核疫苗每年贡献收入超10亿，利润超4亿在研重磅产品-重组结核杆菌融合蛋白（诊断试剂）产品进度：与公司母牛分枝杆菌疫苗同步研发，该产品于2013年8月开展III期临床，并于2018年9月申请新药生产注册获得受理。诊断试剂市场情况：世界卫生组织 2014及2017版《潜伏结核感染管理指南》建议使用γ -干扰 素释放试验(IGRA)或结核菌素皮试(PPD)检测结核潜伏感染，而前者操作复杂、价格昂贵不适合大规模人群筛查和贫困地区使用，后者难以鉴别卡介苗接种与结核杆菌感染特异性差异。二级市场表现市盈率（简称P/E或PER），也称“本益比”、“股价收益比率”或“市价盈利比率（简称市盈率）”。是衡量企业估值的重要指标。三家企业对比发现，智飞生物的市盈率（动）及市盈率（TTM）均最低。自身对比，智飞生物的市盈率处于历史低点。净资产收益率是衡量一家企业是否赚钱的重要的指标。代表企业的净资产有多少是转化为了公司利润。三家企业在近三年的净资产收益率总体是一个上升的趋势。随着智飞生物这两三年自研疫苗和代销疫苗业绩的大幅增长，ROE净值和增速都是最大的。其次，对ROE进行分解，来看其盈利是靠什么因素驱动的。净资产收益率=营业净利润率*总资产周转率*权益乘数；营业净利润率=净利润/营业收入；利润空间总资产周转率=营业收入/资产总额；赚钱快慢权益乘数=1/（1-负债总额/资产总额）；杠杆高低一家企业的经营情况好不好，赚了多少钱，除了看营业收入、净利润等利润表的数据外，更重要的要看现金流量表。这是体现企业的钱流向了哪里，花在什么地方；钱回来了多少，都是什么钱。很多时候看现金流量表的重要性要超过利润表，后者只是结果，而前者是内在逻辑。经营现金流净值为正，说明公司通过开展业务能够收回现金，可以不断再投入;投资现金流净值为负，说明公司有多余现金可以进行对外投资;筹资现金流净值为负，说明公司有多余现金可以对外支付利息、现金分红;因此，公司近两年的现金流健康。智飞生物最近两年的经营现金流净额和净利润的比值均小于1，且有所下降。说明其经营现金流的增速，赶不上净利润的增速。营业成本大幅增长：其营业成本的增加主要为代理生物制品的采购成本。2016-2018年，营业成本中采购成本由2.25%增加到96.54%。营业收入大幅增长：其营业收入的增加主要为代理二类苗的收入。2016-2018年，营业收入中二类苗的代理收入由0.66%增加到74.36%。营业成本增速显著大于营业收入增速综上，2017年开始，智飞生物业务类型转变，其代理销售为主的业务模式不同于可比公司的自研销售，因此，毛利率的变化趋势也不相同。这不但不影响智飞生物的ROE和其他三家一样逐年大幅上涨。相反，其净利润的增速，远远大于净资产的增速，ROE持续稳步走高。企业运营能力主要看两个指标：应收账款周转天数、存货周转天数，这两个指标主要体现企业应收账款变现速度和存货变现速度。从上表可以看出，智飞的应收账款周转天数和存货周转天数近三年大幅缩短。相比其他三家来看，其存货变现速度和应收账款回现速度在逐渐加快，具有显著优势。说明公司的资产运转效率高。总结ENDIVC2024第四届核酸疫苗与创新型疫苗论坛议程曝光点击图片查看，大会火热进行中，明天精彩继续：戳这里，阅读原文立即领取免费参会入场券

中文摘要近年来，过继性细胞免疫疗法在肿瘤治疗方面展现出了显著的临床效果。T细胞和自然杀伤（natural killer，NK）细胞是临床常用的过继性免疫细胞，并且在淋巴瘤等恶性肿瘤的治疗中已经取得了良好的效果。通过对免疫细胞进行基因工程改造引入嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）催生了CAR-T和CAR-NK细胞疗法。CAR-T和CAR-NK细胞可高效识别肿瘤抗原且肿瘤细胞杀伤效果较好，在多种癌症研究中均有满意的结果，已经成为一个炙手可热的领域。此文对基于CAR修饰的免疫细胞疗法的发展与应用进行概述，并针对其挑战与未来发展进行了讨论。正文1细胞免疫治疗肿瘤生物治疗是一种新兴肿瘤治疗模式，主要包括肿瘤免疫治疗、溶瘤病毒治疗、干扰小RNA技术疗法等。肿瘤免疫治疗通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫应答，从而控制与清除肿瘤，比传统的肿瘤治疗方法更加安全并且具有特异性，对晚期肿瘤具有显著的疗效。肿瘤免疫治疗包括4大类：过继性细胞免疫疗法、肿瘤疫苗、非特异性免疫刺激以及免疫检查点单克隆抗体。其中过继性细胞免疫疗法是目前研发热点，也是肿瘤治疗研究中开展最广泛、最深入的领域之一，其具体过程是通过对自体或异体免疫细胞进行体外激活或基因修饰，扩增出足够的具有抗肿瘤活性的免疫细胞后回输给患者。过继性免疫细胞主要包括T细胞、自然杀伤（natural killer，NK）细胞、肿瘤浸润淋巴（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）细胞、淋巴因子激活的杀伤（lymphokine-activated killer，LAK）细胞、细胞因子诱导的杀伤（cytokine induced killer，CIK）细胞、巨噬细胞和树突状细胞（dendritic cell，DC）等几大类。将免疫细胞的杀伤活性与抗体的特异性相结合，通过对免疫细胞进行基因工程改造引入嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）使其靶向表达特定抗原的肿瘤细胞，推动了CAR-T和CAR-NK细胞疗法的发展。CAR是CAR-细胞的核心部分，它使细胞能够不依赖于HLA而通过CAR结构识别更广泛的肿瘤靶抗原。CAR基本结构包括肿瘤相关抗原结合域、通常来自单克隆抗体的抗原结合区域的单链抗体（single chain variable fragment，scFv）、胞外铰链域、跨膜域和胞内信号域。scFv可以与肿瘤细胞表面表达的肿瘤相关抗原紧密结合，这决定了 CAR结构的特异性。铰链域是细胞外区和跨膜域之间的连接序列，它给予CAR充分的定向性和灵活性来与肿瘤抗原结合，会影响CAR-细胞的活性。跨膜域位于铰链和胞内信号域之间，包括CD3 HLA-A2或CD28。胞内信号域的结构决定了CAR-细胞激活信号的强度，其中包含免疫受体酪氨酸激活基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）。目前最经典的胞内结构域是CD3 ITAM的激活区。为了提高CAR修饰的效应细胞的增殖和细胞毒作用，可在胞浆尾部加入共刺激蛋白受体，如CD28、4-1BB、CD134、ICOS等。针对CAR结构的研究除了选取合适的靶向位点scFv，很多研究专注于作为CAR-细胞功能关键区域的胞内信号域，目前已经发展了4代。第1代CAR介导的细胞激活仅通过CD3ζ链完成，抗肿瘤活性有限。第2代CAR在胞内结构域中增加了1个新的共刺激信号，包括1条CD3ζ链和1个共刺激分子对CD3ζ链的信号进行放大，并与其具有相同的抗原特异性，增加了细胞增殖、细胞因子分泌和抗凋亡蛋白的分泌。广泛使用的共刺激分子有 CD28、4-1BB和 CD134（OX40）等。第3代CAR包括1条CD3ζ链和2个或2个以上不同的共刺激分子，使其抗肿瘤效应进一步提高。第4代CAR则通过基因修饰分泌特定的细胞因子或表达额外的共刺激配体增强CAR-细胞的疗效，同时引入了自杀基因系统控制CAR-细胞活性，必要时激活使CAR-细胞凋亡，防止对自体造成损害。CAR结构在免疫细胞中的广泛应用，引导免疫细胞特异性靶向识别肿瘤抗原并介导免疫细胞的激活，从而提高了过继性免疫疗法的适用性和有效性。CAR-细胞对血液肿瘤的治疗具有良好的效果，在实体肿瘤的治疗上也取得了一定的进展，表1中列出了近期CAR-细胞治疗的临床研究。本文对CAR-细胞疗法发展与现阶段应用进行概述，并对不同种类的CAR-细胞治疗的特点及优势进行总结，分别介绍了各自的潜力及应用，并针对其挑战与未来发展进行了讨论。2CAR修饰的T细胞2.1CAR-T细胞概述T细胞在细胞介导的免疫应答中起着关键作用，参与监测和杀死肿瘤细胞或潜在的恶性细胞。基于T细胞的过继免疫疗法治疗恶性肿瘤，特别是血液病癌症效果显著。这种新出现的治疗包括3个模型：TIL、T 细胞受体（T cell receptor，TCR）修饰的T细胞（TCR-T）和CAR-T。与CAR-T疗法相比，前两种技术并没有对T细胞本身进行大的修饰，疗效并不显著，较低的成功率以及对疫苗的依赖也限制了它们的发展。作为一种很有前途的过继免疫治疗方案，CAR-T细胞疗法已接受了超过25年的时间考验，能够识别和消除特定的癌细胞，独立于 MHC。现阶段全球范围已开展的临床试验以第2代CAR-T为主，以CD28或CD137共刺激域构成。一般认为，CD28所传递的活化信号，相较于CD137更强，可使T细胞在较短时间内达到很高的杀伤活性；而CD137所传递的活化信号则会维持得更久。此外，由于CAR-T细胞常常无法进入肿瘤内部，因此主要用于治疗血液系统肿瘤，在实体瘤的治疗中还未见显著的成效。第4代CAR-T细胞在CAR的设计中添加了细胞因子或者趋化因子的受体结构，从而增加T细胞在肿瘤组织中的浸润，以达到增强杀伤实体瘤的效果。2.2CAR-T细胞在抗肿瘤治疗中的应用美国FDA共批准了 5款CAR-T细胞产品上市，分别是瑞士诺华公司的Kymriah用于治疗急性B 淋巴细胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）、美国吉利德公司的Yescarta用于治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）以及Tecartus用于治疗套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、美国百时美施贵宝公司的Breyanzi用于治疗复发或难治性（ralapsed/refractory，R/R）大 B 细胞淋巴瘤（R/R large B cell lymphoma，R/R LBCL）、美国百时美施贵宝公司和Bluebird Bio公司共同研发的Abecma用于治疗多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）。中国有2款CAR-T细胞产品获批上市，分别为上海复星凯特生物科技有限公司的阿基仑赛注射液用于治疗成人R/R LBCL、上海药明巨诺生物科技有限公司的瑞基仑赛注射液用于DLBCL。上述产品中除Abecma为APRIL靶点外，其余都是CD19靶点。随着大量临床研究的开展，针对不同靶点的CAR-T细胞还有望应用于急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）、慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）、B细胞淋巴瘤（B cell lymphoma，BCL）、MM及实体瘤等。目前治疗ALL，特别是高病死率的R/R B-ALL最适合的方法就是CAR-T细胞治疗，其中最有效的是抗CD19抗体CAR，CD19是B细胞的重要生物标志物，在B-ALL中有较高的表达。尽管CD19是CAR-T细胞治疗ALL的理想靶点，但研究发现“抗原逃逸”是免疫疗法发展的潜在障碍，当务之急是进行优化，包括识别其他靶点。CD22是CAR-T细胞的另一个潜在靶点，2种不同的抗CD22药物已经在临床试验中用于治疗B-ALL，以弥补抗CD19治疗的不足。由于CLL发病机制导致早期免疫缺陷，因此CAR-T细胞治疗的疗效受到来自CLL患者的T细胞体外扩增困难及体内增殖反应的限制。Ibrutinib是一种不可逆的布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂，它不仅可以避免对T细胞的负面影响，还可以提高其抗肿瘤能力。有研究表明，5个周期的Ibrutinib治疗增强了靶向CD19的第2代CAR-T细胞（CTL019）的扩增，并降低了程序性细胞死亡蛋白1在T细胞上的表达；同时增加了 B细胞中CD200的表达，而CD200/CD200受体在调节抗肿瘤免疫方面发挥重要作用。CAR-T细胞是治疗R/R B细胞非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma，NHL）的最新免疫疗法，除抗CD19 CAR-T细胞外，4次跨膜蛋白CD20出现在90%以上的BCL中，是公认的NHL治疗靶点。目前，第1代抗CD20 CAR-T细胞治疗已经在一些研究中使用。CD30是TNF受体（TNF receptor，TNFR）超家族的成员，也可以作为淋巴瘤治疗的潜在靶点。在霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma，HL）中，它是Ki-1抗体的抗原，与里德-斯德伯格细胞结合。CD30阳性淋巴细胞主要分布在淋巴组织的滤泡区周围，而在生发中心不常见。对于淋巴瘤，CD30在经典的HL、间变性大细胞淋巴瘤、DLBCL、原发性纵隔BCL和外周T细胞淋巴瘤中表达。有研究报道，靶向CD30的CAR-T细胞在经高强度淋巴清除预处理后的R/R HL患者中表现出显著的抗肿瘤活性和较低的毒性。MM是一种骨髓来源的难治性恶性肿瘤，由于骨髓瘤的异质细胞遗传学和分子异常原因，这种疾病仍然无法治愈。膜蛋白CD138属于硫酸肝素蛋白聚糖的Syndecan家族，在恶性和分化的浆细胞表达，也存在于肿瘤、成熟的上皮细胞和其他正常组织中。由于CD138在几乎所有MM患者中都有表达，因此被用作主要诊断标志物。临床试验结果显示，使用第2代抗CD138 CAR-T细胞治疗5例难治性MM患者后，4例病情稳定，1例晚期浆细胞白血病患者外周血骨髓瘤细胞减少，这表明CAR-T细胞已经进入骨髓。由此可见，抗CD138 CAR-T细胞治疗MM具有良好的耐受性和潜在的抗肿瘤免疫效果。2.3CAR-T细胞面临的挑战CAR-T细胞治疗面临的主要问题是如何提高过继性细胞的有效性和持久性，以及减少治疗的不良反应。为了增强治疗效果，可以通过添加新的共刺激域或CAR部分来提高CAR-T细胞的有效性和持久性。糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白（glucocorticoid-induced TNFR-related protein，GITR）即CD357和4-1BB都是核因子-κB诱导的TNFR超家族成员，而GITR是组成性表达于T细胞的共刺激分子，添加该结构域或结合CD28和4-1BB可以进一步增强T细胞的作用。对于淋巴瘤、MM和其他类型的恶性肿瘤中存在的抗原逃逸或多种肿瘤抗原共存现象，重建CAR部分是一种新的方法。双特异性CAR-T细胞是很有前途的治疗方法，它包括2种形式：（1）1个CAR由2个不同的scFv组成（TanCAR），或者2个不同的CAR在1个T细胞上连接不同的scFv（双信号CAR）；（2）依次或同时注入不同类型的CAR-T细胞池。此外，使用带有趋化因子基因的溶瘤病毒招募CAR-T细胞，可延长它们的持久性并直接攻击肿瘤细胞。这是一种很有前景的方法，可用于血液系统恶性肿瘤的检测。溶瘤病毒可以感染宿主，复制并破坏某些肿瘤细胞，而不伤害正常细胞。有证据表明，肿瘤细胞可以通过MHCⅠ在其细胞质中整合呈递新病毒蛋白，被CD8+ T细胞识别和摧毁。使用黏液瘤病毒、5型腺病毒和柯萨奇病毒A组21型等病毒杀灭这种类型的肿瘤细胞的应用已在MM中报道。在CAR-T细胞治疗过程中，避免失控的T细胞增殖、细胞因子风暴或靶向/非靶向肿瘤效应至关重要，可以激活自杀基因（也称为消除基因）系统来破坏注入的CAR-T细胞，调节CAR-T细胞的扩增并限制毒性。目前，单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦自杀基因治疗在同种异体造血干细胞背景下已经显示了其安全性和有效性；其他非免疫原性自杀系统，如经过修饰的内在凋亡途径中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（caspase 9，Cas9）也已经被开发出来。然而，这种自杀策略是通过彻底消除CAR-T细胞来缩短治疗时间。“可转换的”CAR-T细胞弥补了这个缺陷，通过在scFv和T细胞表面之间插入一个小的分子复合物来启动细胞功能并通过停止添加它来关闭细胞功能。另一种切换细胞开启和关闭的方法是设计可溶性细胞间分子，包含肿瘤抗原特异性抗体，通过改变中间分子的浓度来改变细胞功能。CAR-T细胞治疗在治疗恶性血液病，特别是ALL、CLL和淋巴瘤取得了很大的进展，而有效性、细胞持久性和不良反应成为广泛应用的瓶颈，需要更加创新的实验室研究来加强该疗法的有效性。3CAR修饰的NK细胞3.1CAR-NK细胞概述NK细胞是机体内天然免疫系统的核心细胞。与T细胞不同，NK细胞对靶细胞的识别不依赖于MHC的表达，而是依赖于其表面杀伤细胞激活受体和杀伤细胞抑制受体（killer inhibitory receptor，KIR）间的动态平衡。当NK细胞表面的KIR识别出自身MHCⅠ的时候，NK细胞会主动失活，保护宿主细胞不受误攻击；在MHCⅠ改变、缺失或表达较低的肿瘤细胞中，KIR介导的抑制作用减弱，NK细胞以“缺失自我标记”为靶点对肿瘤细胞造成杀伤。NK细胞的杀伤作用主要体现在，NK细胞可以直接释放穿孔素和颗粒酶B，执行诱导靶细胞凋亡的作用；同时，NK细胞可以分泌大量细胞因子，如TNF-a、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、IFN-γ、IL-3等，对靶细胞起到直接作用，或激活其他种类的免疫细胞对靶细胞进行攻击；NK细胞还能表达Fas配体和TNF相关调亡诱导配体，使靶细胞进入程序性凋亡；最后，NK细胞通过其表面CD16与靶细胞表面的抗原决定簇特异性结合从而发挥抗体依赖的细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）作用。除了具有强大的杀伤功能外，NK细胞还具有很强的免疫调节功能，分泌多种共刺激分子，募集和激活其他免疫细胞，如DC和巨噬细胞，间接帮助消灭靶细胞，从而调节机体的免疫状态和免疫功能。目前NK细胞所用CAR结构大多沿用自CAR-T细胞。大多数CAR-NK细胞使用CD3-ITAM作为信号转导区域进行信号转导，并利用CD3-ITAM启动NK细胞杀伤。CD3ζ二聚体可以传递来自CD16的信号，从而有助于ADCC作用。除单一的CD3型ζ链之外，胞内信号区还包括共刺激结构域，如CD28、CD137（4-1BB）或CD244（2B4）等分子，具有很好的信号转导效应，有助于CAR-NK细胞的杀伤作用。不同的共刺激分子对NK细胞的作用也不同，如在ALL异种移植小鼠模型中，CD244对CAR-NK92细胞的刺激作用强于CD137，可以募集并激活酪氨酸激酶启动激活信号，可能更适合作为CAR-NK细胞的胞内信号域。与CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞具有多种优势。首先，NK细胞易分离，寿命较短，体内转移的CAR-NK细胞不易过度增殖，导致移植物抗宿主病（graft versus-host disease， GVHD）的风险低。其次，NK细胞分泌的细胞因子主要包括IFN-γ和GM-CSF，比活化CAR-T细胞释放的细胞因子如TNF-а、IL-6、IL-2、IL-8 等更加安全，这些由CAR-T细胞产生的促炎细胞因子可能导致细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS）和神经毒性。除了以CAR依赖的方式杀伤肿瘤靶细胞外，CAR-NK细胞还能以CAR非依赖的方式消除癌细胞，发挥自身天然的杀伤肿瘤细胞的活性，如通过激活NK细胞受体NCR、NKG2D、共刺激受体DNAM-1（CD226）和某些激活的KIR（KIR2DS1、KIR2DS4和KIR2DL4 ）等上调被激活。其次，CAR-NK细胞可以通过表面的CD16介导ADCC作用清除肿瘤细胞。CAR-NK细胞拥有CAR依赖和NK细胞受体依赖的双重杀伤机制，可以有效根除一些不表达CAR所靶向抗原的异种肿瘤。最后，NK细胞可从PBMC、NK细胞系和诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）等中直接获取，价格更加便宜。CAR-NK细胞中的NK细胞可以从多种来源大规模生产，包括NK-92细胞系、外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）、脐带血（umbilical cord blood，UCB）、CD34+ 造血祖细胞（hematopoietic progenitor cells，HPC）和iPSC。目前大多数CAR-NK细胞的临床试验使用的NK92细胞系在体外具有无限的增殖能力，对反复冻存、解冻的敏感性降低，使生产时间更短，成本更低。然而，NK92细胞系为肿瘤细胞系，具有潜在致瘤风险，缺乏CD16和NKp44的表达，且在输注前需要辐照而失去体内扩增潜力。PBMC是NK细胞的重要来源，GVHD风险低，可以从健康捐赠者PBMC中分离出足够数量的NK细胞，其中90%是成熟表型的CD56dimCD16+ NK细胞，细胞毒作用更强但增殖能力下降，且这种来源的CAR-NK细胞无需辐照处理。同样的方法也适用于从UCB分离NK细胞。UCB的优势是可以选择具有特定HLA类型和特定NK细胞受体特征的供者。然而，UCB单位体积有限，NK细胞数量较少、表型不成熟，黏附分子CD16、穿孔素和颗粒酶B的表达减少，NKG2A等抑制受体表达增加，使获取足够数量的临床级NK细胞成为挑战。同时，PBMC和UCB来源的CAR-NK细胞由不同供者提供，使产品很难标准化。从CD34+ HPC中分化NK细胞是获得大量临床级成熟NK细胞的另一种途径。CD34+HPC可以从骨髓、胚胎干细胞或UCB中分离，在培养系统中扩增和分化为成熟的NK细胞。除上述来源外，iPSC由于可以更有效地设计以稳定表达CAR而成为新兴的CAR-NK细胞来源，从单个CAR-iPSC细胞出发就足以分化为大量高度同源的CAR-NK细胞产品用于临床，为CAR-NK细胞提供了一种可再生的来源。然而，与UCB NK细胞类似，iPSC来源的NK细胞通常表型不成熟。3.2CAR-NK细胞在抗肿瘤治疗中的应用使用非CAR工程化的NK细胞进行免疫治疗已显示出良好的效果，而用基因工程化的CAR-NK细胞可以提高临床疗效。在恶性淋巴肿瘤的临床研究中，CD33和CD19是CAR-NK细胞疗法最常见的靶点。Tang等首次将CAR-NK-92细胞应用于临床试验。他们构建了包含CD28和4-1BB共刺激分子在内的第3代慢病毒载体，并在CD33的scFv和CD28之间插入Fc片段来检测转导的CAR-NK细胞。用上述构建的CD33-CAR载体转导经改造的能够表达IL-2的NK-92-MI细胞，并确认转导效率达90%以上。经过符合GMP级生产要求的细胞转导与培养后，CD33-CAR-NK-92细胞在体外对人早幼粒白血病细胞系HL-60展现了良好的杀伤作用。接着，他们对3例R/R急性髓系白血病（acute myloid lymphoma，AML）患者进行挽救化疗，没有观察到明显的不良反应，证明以5×109个CD33-CAR-NK-92细胞剂量进行输注并辐照是安全的。输注后，患者的血液中能够检测到CAR-NK-92细胞。Liu等对11例R/R NHL或CLL患者进行了UCB来源的HLA不相合的抗CD19-CAR-NK细胞治疗。将携带抗CD19、CD28跨膜区和CD28ζ信号内域的scFv的逆转录病毒载体与人IL-15基因和可诱导的Cas9自杀基因结合，导入UCB来源的NK细胞。体外扩增CAR-NK细胞，并在淋巴清除化疗后对患者进行一次性输注，未观察到明显的GVHD和CSF。在接受治疗的11例患者中，8例恶性肿瘤有一定程度的缓解，其中7例得到完全缓解。输注后的CAR-NK细胞可以扩增并维持一定水平至少12个月。这些已应用于临床的CAR-NK细胞治疗方案展现了 CAR-NK细胞对B细胞系恶性肿瘤的抗癌作用是有效且安全的，且疗效均强于非CAR-NK细胞治疗。临床前研究表明CAR-NK细胞具有很强的抗肿瘤功能，但在实体瘤中的临床应用尚处于起步阶段。目前有多项临床前试验研究CAR-NK细胞疗法治疗多发性实体瘤的疗效，如神经母细胞瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌等。Liu等用表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）作为治疗三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）的靶点，研究了EGFR-CAR-NK细胞在体内外对TNBC细胞的杀伤作用。将抗EGFR scFv的DNA片段克隆至带有CD8较链、CD28跨膜区域、4-1BB和CD3ζ胞内信号域的第3代CAR慢病毒载体中，并转导NK细胞。结果表明，EGFR-CAR-NK细胞可以被表达上调的TNBC细胞激活，并在体外特异性地触发TNBC细胞的裂解，并对小鼠体内乳腺癌细胞来源的异种移植和患者来源的异种移植肿瘤均有抑制作用。除此之外，EGFR-CAR-NK细胞可通过同时触发TNBC细胞凋亡来提高疗效，表明EGFR-CAR-NK细胞对治疗TNBC是有潜力的治疗策略。Cao等也以间皮素（mesothelin，MSLN）作为治疗胃癌的靶点，将抗MSLN 的 scFv （NKG2D跨膜区，结合 2B4-CD3 胞内信号结构域）克隆到慢病毒载体中，并转导NK-92细胞得到MSLN-CAR-NK细胞。结果表明，MSLN-CAR-NK细胞在体外对MSLN阳性的胃癌细胞具有特异性杀伤作用。此外，与非CAR工程化的NK-92细胞和CD19-CAR-NK细胞相比，MSLN-CAR-NK细胞可分泌更强的细胞因子，并可以有效清除小鼠体内皮下和腹膜肿瘤模型的胃癌细胞，对异种移植的胃癌具有较强的抗肿瘤和NK细胞浸润能力，显著延长了小鼠的存活时间，证明针对胃癌的MSLN靶点是非常具有潜力的。CAR-NK细胞具有很大的临床应用潜力，进一步的研究正在将CAR-NK细胞治疗的临床前结果转化至临床。3.3CAR-NK细胞面临的挑战CAR-NK细胞疗法是近年来发展起来的一种治疗肿瘤的免疫治疗方法，尽管在临床前研究中取得了不错的进展，但CAR-NK疗法的临床应用仍处于起步阶段，并面临着一些挑战。我们希望通过对当前挑战进行阐述，并讨论未来的改进方法，以改善临床环境下的CAR-NK的治疗结果。NK细胞的扩增是CAR-NK细胞生产的重要步骤之一，需要大量的CAR-NK细胞才能达到最佳的临床疗效，因此产生足够数量的NK细胞仍然是CAR-NK疗法的主要挑战。多种细胞因子，如IL-2、IL-15、IL-12、IL-21和IL-18等已被用于体外扩增原代NK细胞，但效果有限，而在开发出合适的人造APC（artificial APC，aAPC）后可以特异性并大量扩增NK细胞。Shah等使用以K562为基质表达膜结合型IL-21的aAPC在14 d的NK细胞共培养中，使UCB NK细胞的平均扩增倍数达到了2 389倍，而仅添加IL-2的NK细胞在14 d的培养中平均扩增倍数只有20倍，表明aAPC在NK细胞扩增中具有显著的促进作用。而在Denman等的研究中，膜结合型IL-21的K562还可以延缓NK细胞的端粒缩短，而端粒缩短情况也被认为是限制NK细胞分裂能力的重要因素之一。为获得足够数量的NK细胞用于CAR转导，需要开发更多、更有效的临床级别体外扩增方法。除了扩增的挑战外，CAR-NK细胞的CAR结构以及转导过程仍面临诸多问题，同时也有很多研究正在努力解决这些挑战。由于CAR结构最先用于T细胞，而针对NK细胞的CAR最优结构的设计尚未被系统地研究。CAR结合表位的位置及其与NK细胞表面的距离可能影响与抗原的结合、免疫突触的最佳形成和CAR-NK细胞的激活，同时不同来源的NK细胞对共刺激信号要求也不尽相同。Li等通过表达特制的CAR结构，能促进由iPSC分化的NK细胞的激活，这种含跨膜NKG2D和胞内2B4结构域的构建体比CAR-T构建体性能更好。因此，针对NK细胞独特的激活受体和信号激活蛋白而定制的基于NK细胞的CAR结构潜力巨大。除此之外，目前所开发的CAR大多针对癌细胞上差异表达的非突变自身抗原，导致CAR可能与正常组织上表达的抗原非特异性结合，对健康组织也造成损害。针对这一问题，可以导入自杀基因，如诱导型Cаs9，控制CAR活性剂量；也有研究指出，如果2个单独的结构或2个胞外结构域以串联形式结合，产生双特异性CAR，细胞毒性会有效降低；split CAR构造，使用小分子的二聚化以形成功能单元。而在转导过程中，目前主流的导入CAR的方式为逆转录病毒转染。但这种方法依赖宿主细胞的分裂，NK细胞在未激活时转导效率会下降。同时，逆转录病毒转染后可能存在遗传毒性，并可能触发相关机制使NK细胞凋亡。针对这一问题，有研究指出可以使用RNA工程，NK细胞的存活率和转染效率会更高。CAR-NK细胞治疗作为一种新的过继免疫治疗手段具有巨大的潜力和可行性，但仍存在许多问题需要解决。如果这些问题得到解决，CAR-NK细胞疗法将成为对抗肿瘤的强大手段。4以iPSC为平台生产CAR-T/NK细胞4.1iPSC概述2006年，山中伸弥团队在小鼠胚胎和成人成纤维细胞中诱导多能性的4个转录因子一Oct3/4、Sox2、Klf4和cMyc，实现了体细胞向多能干细胞的重编程。iPSC可在体外无限扩增，并且理论上可分化成任何细胞类型，在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似，同时避开了伦理问题，在疾病模拟、药物筛选和细胞治疗中有着巨大的应用前景，是细胞疗法的理想细胞来源。iPSC体外培养时如果通过构建合适的环境，模拟体内发育过程，理论上可分化成任何细胞类型，包括T细胞和NK细胞。iPSC衍生的T/NK细胞能够为临床治疗提供同质且基因明确的细胞群体，消除了使用外周血或UCB来源的T/NK细胞时供者间的差异。此外，通过使用各种基因编辑技术，如病毒载体、转座子或成簇规律间隔短回文重复序列Cas9系统，可以对未分化的iPSC进行遗传操作以产生均一的目标细胞群细胞如CAR-T/NK细胞，这些优势使iPSC衍生的细胞成为“现货型”细胞疗法的理想细胞群。4.2iPSC衍生的CAR-T/NK细胞在抗肿瘤治疗中的应用2013年，Sadelaint团队用编码二代抗CD19-CAR的慢病毒载体转导外周血淋巴细胞来源的iPSC，收获的iPSC-CAR-T细胞表现出与CAR-TCR-γẟ外周血淋巴细胞类似的抗肿瘤活性。Kanfman团队用iPSC生产的NK细胞表达的激活和抑制受体与外周血NK细胞相似，并且在体外和体内都表现出强大的抗肿瘤和抗病毒活性。为了提高CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，2018年，Kanfman团队构建了具有NK细胞特异性激活域（NKG2D-2B4ζ）的CAR-NK细胞并以PiggyBac转座子为载体将其编码基因整合至iPSC，所收获的NK-CAR（NKG2D-2B4ζ）-iPSC-NK 细胞显示出与外周血NK细胞和未修饰的iPSC-NK细胞相似的表型，并且比 T-CAR（CD28-41BBζ）-iPSC-NK细胞表现出更高的抗肿瘤活性。美国Fate Therapeutic公司以iPSC为平台生产的CAR-NK细胞和CAR-T细胞产品均已进入Ⅰ期临床研究。FT596是由iPSC衍生的CAR-NK细胞产品，除了表达靶向B细胞抗原CD19的CAR，FT596还表达高亲和力且不可清除的CD16受体以增强ADCC，及IL-15受体融合蛋白以增加CAR-NK细胞的体内存活时间。目前公布的Ⅰ期临床试验结果显示，在接受FT596治疗的14例R/R BCL患者中，10例（71%）患者获得客观缓解，其中7例（50%）获得完全缓解。安全性方面，数据显示FT596疗法耐受性良好，未观察到神经毒性综合征、GVHD等。除了FT596外，该公司的FT500、FT516、FT538和FT576均为由iPSC衍生的NK细胞产品且都已进入Ⅰ期临床研究。FT819是首个由iPSC衍生的CAR-T细胞产品，除了表达靶向B细胞抗原CD19的CAR，FT538完全消除了内源性TCR的表达以及GVHD。临床数据显示，FT819在体内对表达CD19的白血病和淋巴瘤细胞系具有抗原特异性的细胞毒性，与健康的供体来源的CAR-T细胞相当；骨髓评估显示，FT819能够在体内持续存在并继续表现出肿瘤清除能力。iPSC细胞系作为一种可再生细胞来源，能够大规模生产高质量的同种异体CAR-T/NK细胞，具有更高的产品一致性、现货供应和更广泛的患者可及性，有望成为未来细胞疗法领域的重要方向。4.3iPSC衍生的CAR-T/NK细胞面临的挑战iPSC衍生的NK细胞和T细胞在近几年发展迅速，提供了可以即取即用的产品，能够极大降低肿瘤免疫治疗的成本，形成一种可以提前生产、储备，具有可预期疗效的免疫细胞治疗产品。iPSC衍生的细胞治疗产品从科研端走向临床仍面临着诸多新的挑战。其中，能够在临床应用需要克服的重要挑战之一是确立符合临床使用要求的有效细胞分化策略。虽然在基础科学研究中，已经有多项实验报道可以将iPSC成功分化为T细胞和NK细胞，然而很多分化方案仍然使用了血清和滋养层细胞，存在外源因子污染的安全性风险，不符合各国药典规则。iPSC的分化策略直接影响到最后生成的T细胞或者NK细胞的表型是否与人体中自然产生的细胞相同，不同企业或机构最后生产出的细胞产品性状很可能大不相同。此外，iPSC具有无限增殖的潜力，如果未分化的iPSC被输入到患者体内，可能具有产生肿瘤的潜力。因此，需要设定安全检查或者基因工程改造策略，将这一风险最小化。目前，对iPSC衍生的细胞治疗的功能陈述还没有建立统一的标准，如何规范基于iPSC衍生的细胞治疗产品工艺的稳定性也是目前亟需解决的问题。5CAR修饰的其他免疫细胞由于肿瘤微环境（tumor micro-environment，TME）和缺乏特异性靶向肿瘤抗原，CAR-T细胞在实体瘤中的应用仍然受到严重限制，除了 NK细胞，目前针对许多实体瘤的新策略是将CAR应用到巨噬细胞、DC和CIK细胞中。巨噬细胞M1表型具有促炎和抗肿瘤活性，在2类实体瘤异种移植小鼠模型中，CAR-巨噬细胞靶向MSLN或人表皮生长因子受体2，在人红白血病细胞中表现出抗肿瘤吞噬活性，降低了肿瘤负荷，并延长了总生存期；TME中的另一个关键作用细胞是起APC作用的DC，它可以启动幼稚T细胞并重新激活记忆应答，并与细胞毒性CD8+细胞交叉呈递，促进更强的抗肿瘤应答，Suh等用4-1BB抗CD33的CAR转导了 DC，在AML模型中对其进行了测试，经CAR-T/CAR-DC治疗的小鼠AML的负担明显减少，存活率也随之增加；CIK细胞也是备受关注的一类效应细胞，其具有经典NK细胞以及CD4+和CD8+ T细胞的共同特征，可以通过多种受体识别病原体，人表皮生长因子2-CAR-CIK细胞可完全消除人肺泡横纹肌肉瘤，而野生型CIK细胞仅能实现部分肿瘤生长抑制，而且使用CAR-CIK细胞没有严重CRS或GVHD的迹象。癌症的免疫编辑和耐药性在抗癌免疫疗法中十分常见，许多癌症通过失去MHCⅠ抗原呈递机制来逃避免疫控制，高达50%的ALL和LBCL患者中都发现CD19丢失引发的免疫逃逸，这些患者在抗CD19 CAR-T细胞治疗后复发。与自体CAR-T细胞产品中的主要细胞类型αβ T细胞不同，γẟ T细胞具有先天和适应性免疫系统的特性，它们可以以不依赖MHC的方式发挥作用，具有多种杀伤机制，并将抗原交叉呈递给αβ T细胞，靶向二唾液酸神经节苷脂2（ disialoganglioside 2，GD2）的γẟ CAR-T细胞能够向肿瘤细胞迁移和抗原交叉呈递，并增强了GD2在癌细胞系中的特异性杀伤，在另一项研究中，Rozenbaum等证明γẟ CAR-T细胞能够靶向那些失去C19（即抗原阴性）的CD19白血病细胞。记忆性T细胞和Treg作为免疫细胞，因其不会引起GVHD，也被CAR修饰后用于免疫治疗。Fernandez等构建表达NKG2D的CAR-记忆性T细胞，可以靶向清除表达NKG2D配件的骨肉瘤细胞，也是一种很有前途的骨肉瘤免疫治疗方法；Treg是一种能抑制传统T细胞和其他免疫细胞功能的T细胞亚群，针对其免疫抑制特性，目前也已开发CAR-Treg疗法治疗移植排斥以及一系列自身免疫性疾病。6展望过继性细胞免疫治疗是近年来发展迅速的一种个性化免疫治疗方法。而通过基因工程改造的方式对过继性免疫细胞进行CAR修饰，进一步提高了其识别肿瘤抗原的能力和对肿瘤细胞的杀伤效果。其中CAR-T细胞治疗在治疗恶性血液病特别是ALL、CLL和淋巴瘤方面取得了很大的进展，但有效性、细胞持久性和不良反应成为这种方法广泛应用的瓶颈。因此很多研究尝试用CAR修饰其他免疫细胞来代替T细胞，从而提高对实体瘤的治疗效果，同时减轻不良反应。其中，CAR-NK细胞由于杀伤能力强，导致移植物抗宿主病的风险低，同时只会引起较轻的细胞因子风暴和神经毒性不良反应，是除CAR-T细胞外研究最多的CAR修饰的免疫细胞。其他相关技术如以iPSC为平台生产T/NK细胞，CAR修饰应用到巨噬细胞、DC细胞和CIK细胞中以治疗实体瘤等方面均取得了较大突破。CAR修饰的免疫细胞治疗研发具有广泛的应用前景，但有很多问题需要解决才能用于临床治疗，需要进行更多的创新工作研究。作者徐瑞升  陈玉莹  李奇林  谭文松  蔡海波华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 200237通信作者：蔡海波，Email：caihaibo@ecust.edu.cn引用本文：徐瑞升，陈玉莹，李奇林，等.  基于嵌合抗原受体修饰的免疫细胞疗法发展与应用的研究进展 [J]. 国际生物制品学杂志, 2023, 46(5): 273-282.  DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20221125-00081识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入生物制品微信群！请注明：姓名+研究方向！版权声明本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。