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01 引言 抗体药物偶联物（ADCs）通过将单克隆抗体的靶向特异性与高效细胞毒性药物相结合，已成为肿瘤治疗领域的一项革命性策略。ADC起源于20世纪初Paul Ehrlich提出的“魔法子弹”理论，此后经历了四个发展阶段。第一代ADC使用鼠源单克隆抗体，通过不可裂解连接子与传统的细胞毒性药物偶联，导致载荷毒性不足、结构不稳定、毒素易脱离等问题，从而治疗窗口狭窄，失败率高。第二代ADC使用人源化单克隆抗体、更稳定的可裂解连接子和更有效的细胞毒性药物，以解决免疫原性和载荷不可控释放的问题。第三代ADC利用位点特异性偶联技术实现均一的药物抗体比（DAR），减少了毒副作用并增强了疗效，从而拓宽了治疗窗口。目前，ADC已发展到第四代，采用多特异性、多载荷和高DAR值的创新设计。迄今为止，全球已有21种ADC获批上市（表1），超过300种ADC候选药物正在进行临床试验，覆盖多种癌症类型，包括血液系统恶性肿瘤和实体瘤。 尽管ADC在肿瘤治疗中取得了显著成功，且多种药物已获批，但传统的基于单克隆抗体的ADC仍然面临许多挑战，包括靶抗原表达异质性、药物内化不足、载荷相关耐药性以及治疗相关不良事件。为克服这些局限，研究人员提出了多种优化策略，并开发了多种下一代ADC技术。传统ADC有三个关键要素：特异性识别肿瘤相关抗原的抗体、细胞毒性载荷以及连接抗体与载荷的连接子。近年来，ADC的概念已显著扩展，催生了更广泛的XDC平台。靶向部分不再局限于完整的IgG抗体，还包括更小、更具穿透性的模块，如纳米抗体、亲和体、设计的锚蛋白重复蛋白（DARPin）、适配体、靶向肽甚至小分子配体。载荷也已超越了传统的高效小分子细胞毒素，扩展到包括细菌毒素、免疫激动剂、光敏剂、放射性核素、寡核苷酸、PROTAC分子和其他功能性效应分子，从而实现多样化的作用机制、克服耐药性、激活免疫反应或实现时空可控的杀伤。然而，它们也面临着双组分或多组分偶联过程复杂以及新型载荷安全性等挑战。这些发展代表了ADC从单一结构实体向多功能、精准导向治疗药物演进的核心趋势。 当前ADC研究策略主要集中于连接子的可控稳定性、位点特异性与均一性偶联、抗体优化、载荷多样化、旁观者效应的精准调控以及药代动力学/药效动力学（PK/PD）优化。总体目标都是为了提高疗效、降低毒性、克服耐药性并增强对实体瘤的治疗效果，从而推动ADC向更高的均一性、智能化、安全性和广谱适用性发展。我们主要关注抗体组分的优化——包括双特异性ADC、具有改进内化或增强结合亲和力的变体——以及新型载荷组合的探索（图1）。本综述详细阐述了ADC的设计优化策略和最新研究进展，旨在为下一代ADC的创新设计提供启发。 图1. 下一代ADC的当前策略。 主要关注四个核心方向：具有协同效应的双特异性ADC、提高内部化效率、增强结合亲和力和有效载荷组合创新。 02 双特异性ADC 传统的单靶点ADC在临床应用中取得了显著成功，但仍面临诸多挑战，如靶抗原异质性、耐药性以及因靶点在正常组织中表达而引起的“靶向肿瘤-脱靶肿瘤”毒性。为克服这些局限，双特异性抗体药物偶联物（BsADC）应运而生，BsADC能够同时识别并结合两种不同的细胞表面抗原（双靶点ADC）或同一靶蛋白上的两个不同表位（双表位ADC），这种设计不仅能提高对肿瘤细胞的靶向特异性，还可能通过协同效应增强ADC的内吞效率和抗肿瘤活性。 2.1 双靶点ADC 目前已开发出多种双靶点ADC策略，其中许多已进入临床试验（表2）。在本章中，我们主要关注靶向具有协同效应的两种独立肿瘤抗原的双特异性ADC（代表性ADC如图2所示），此类设计旨在通过扩大靶点覆盖范围或减少脱靶毒性来增强协同细胞毒性、克服耐药性和抗原表达异质性。EGFR-HER3/c-MET信号通路中不同靶点的组合已被应用于双靶点ADC，以防止旁路激活并克服耐药性。EGFR是ERBB受体酪氨酸激酶家族的成员，可与HER3或c-MET形成异二聚体，从而触发下游信号通路，促进肿瘤细胞增殖，阻断EGFR可导致通过ERBB受体（如HER2和HER3）的代偿性信号传导。因此，已开发出多种靶向EGFR和HER3的BsADC。其中的代表是百利药业开发的BL-B01D1，它利用同时靶向EGFR和HER3的双特异性抗体SI-B001，拓扑异构酶I抑制剂（TOP1i）ED04通过可裂解连接子连接到SI-B001的半胱氨酸位点，DAR为8。在异种移植模型中，双特异性ADC BL-B01D1的肿瘤抑制活性强于由每种亲本抗EGFR或抗HER3单抗与相同连接子和载荷制备的ADC。临床数据显示，在已发生多药耐药的晚期肺癌和鼻咽癌患者中，BL-B01D1展现出有前景的抗肿瘤疗效。此外，BL-B01D1显示出可接受的安全性和耐受性，为既往接受过多种前期治疗的晚期肿瘤患者提供了一种新的治疗选择，它目前正处于临床III期研究（NCT06118333）。 同样，MET的上调和扩增被认为是抗EGFR治疗的主要逃逸途径之一。靶向EGFR和c-MET的BsADC能够协同高效地杀伤肿瘤，同时延缓耐药性的发生。目前，有三种EGFR/c-MET BsADC已进入I/II期临床试验。由阿斯利康开发的AZD9592（NCT05647122），构建于DuetMab单价双特异性IgG平台支架上，该平台通过引入Fab二硫键防止轻链错配，并通过可裂解连接子与TOP1i载荷AZ0132偶联，DAR为6。其设计对c-MET的亲和力比对EGFR高（>15倍），以减少正常组织中EGFR驱动的毒性。AZD9592在结直肠癌患者来源的异种移植模型中表现出剂量依赖性的抗肿瘤活性，并且对KRAS/BRAF突变或伊立替康耐药的肿瘤仍然有效。由VelaVigo Bio开发的VBC101（NCT07136779） 也具有低亲和力EGFR臂和高亲和力c-MET臂，以确保减少正常组织中EGFR相关的非靶向毒性。与仅靶向c-MET的ABBV-399相比，其IC50提高了五倍。设计中使用纳米抗体使其结构更小，相比ABBV399和AZD9592具有更好的肿瘤穿透和蓄积能力。由ProfoundBio开发的另一种EGFR/c-MET BsADC PRO-1286（NCT06685068），由对EGFR和c-MET具有精细调节亲和力的单价BsAb组成，与TOP1i sesutecan偶联，DAR为8。PRO1286在多种肿瘤细胞系中表现出高效的内吞作用和亚纳摩尔级的细胞毒性效力。在小鼠异种移植模型中，在广泛的靶标表达水平、肿瘤类型和基因组背景下，PRO1286均引发了显著的、剂量依赖性的抗肿瘤活性。 近期的研究揭示了一些用于构建BsADC的新药物靶点，一些设计聚焦于共表达的靶点以增强肿瘤选择性。D'Alessio等开发了一种靶向P-钙粘蛋白（pCAD）和LI-钙粘蛋白（CDH17） 的BsADC，这两种蛋白属于钙粘蛋白超家族。pCAD参与钙依赖性上皮细胞-细胞粘附，并与多种促肿瘤过程相关，包括细胞侵袭、转移和肿瘤发生。CDH17是一种细胞粘附分子，主要通过介导钙依赖性细胞粘附，在维持上皮细胞极性和组织稳态中起重要作用。这两种蛋白在结直肠癌中高度共表达，所设计的BsADC能够选择性地靶向双阳性细胞，而不结合单抗原细胞，从而减少与每种抗原相关的正常组织潜在风险。pCAD/CDH17双特异性ADC的体内研究证明，其在双抗原表达的肿瘤中具有抗增殖作用，而对单抗原表达的肿瘤无影响。 Tang等也靶向CDH17，他们开发了一种同时结合CDH17和鸟苷酸环化酶C（GUCY2C）的双特异性抗体，并将其与铁死亡诱导剂RSL3（一种GPX4抑制剂）结合，创建了一种创新型的BsADC。GUCY2C是一种I型跨膜受体，在正常肠道上皮细胞中表达，在被其激素配体激活后调节肠道稳态和肿瘤发生，他们发现CDH17和GUCY2C在结直肠癌细胞中共同过表达。实验结果表明，与单抗ADC相比，该BsADC表现出更好的结合和内化活性，并能有效抑制肿瘤细胞增殖，同时保持良好的安全性。 Song等开发了一种靶向上皮细胞粘附分子（EpCAM）和紧密连接蛋白3（CLDN3） 的BsADC。尽管EpCAM在多种肿瘤中高表达，但它在正常胃肠道组织中也有表达，限制了单靶点ADC的开发。鉴于CLDN3和EpCAM在多种恶性肿瘤中高度共表达，且CLDN3在正常组织中罕见表达，他们开发了靶向EpCAM和CLDN3的BsADC，以避免对高表达EpCAM的正常组织产生毒性。该BsADC能有效抑制肿瘤生长，同时对仅高表达EpCAM的细胞显示出弱结合，表明其对正常组织的毒性较低。 一些研究也靶向肿瘤中互补表达的靶点，以更全面地清除肿瘤细胞，降低耐药可能性。由艾伯维开发的BsADC ABBV-969 是这种设计的典型代表，ABBV-969靶向前列腺特异性膜抗原（PSMA）和前列腺肿瘤抗原（STEAP1）。PSMA和STEAP1均在前列腺癌中高表达，并表现出互补的表达特征。肿瘤内部和肿瘤之间的异质性表达可能限制治疗效果。ABBV969采用双可变结构域免疫球蛋白（DVD-Ig）形式设计，以同时靶向STEAP1和PSMA。这种形式允许对两个靶点进行二价结合，增加了肿瘤覆盖率和治疗的持久性，ABBV-969已进入I期临床试验（NCT06318273）。 遵循同样的策略，Yao等近期开发了一种人源化双特异性ADC，可同时靶向MET和RON受体。在超过40%的胰腺癌和三阴性乳腺癌病例中，MET和RON的表达存在显著异质性。因此，他们开发了双特异性抗体PCMbs-MR，并与MMAE偶联形成BsADC PCMbs-MMAE。该BsADC能有效诱导MET和RON的内化，并在MET/RON表达异质性的癌细胞系中引发大量细胞死亡，表现出高效且持久的抗肿瘤效果及良好的安全性。 图2.双靶BsADC的设计。 代表性结构包括BL-B01D1（靶向HER3/EGFR）， AZD9592（靶向EGFR/c-MET）， BsADC靶向pCAD/CDH17， GUCY2C/CDH17和EpCAM/CLDN3，以及PCMdt-MMAE（靶向RON/c-MET）。 2.2 双表位ADC 作为BsADC的一种特殊类型，双表位ADC的特征在于其能够同时识别并结合同一靶蛋白上两个不同的、非重叠的表位，从而增强受体聚集，导致靶点的快速内化。目前双表位ADC的研究主要集中在HER2、MET和叶酸受体（FRa） 等靶点上（代表性ADC如图3所示），已有数个候选药物进入临床试验（表3）。 图3.双表位BsADC的设计。 代表性结构包括MEDI4276、ZW49、JSKN003（靶向HER2 ECD2/ECD4）、REGN5093-M114（靶向MET）和IMGN151（靶向FRα）。 (1) 靶向HER2的双表位ADC  在Coats等发表的一项研究中，详细阐述了其机制，他们将曲妥珠单抗的scFv融合到395 IgG1重链的N末端，以特异性结合HER2的胞外结构域2（ECD2）和ECD4。他们发现，这种结构有效促进了HER2受体的聚集，从而加速其内吞、向溶酶体的转运以及最终的降解过程。每条重链上的两个工程化半胱氨酸（S239C和S442C） 允许通过马来酰亚胺己酰基连接子精确连接微管聚合抑制剂微管溶素，从而产生具有明确DAR为4的均一BsADC MEDI4276。在I期临床试验中，MEDI4276在对曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和T-DM1耐药的患者中显示出抗肿瘤活性。然而，在疗效增强的同时，其副作用限制了其临床应用。 ZW49 是基于双特异性抗体ZW25构建的ADC，源自Azymetric Fc平台，结合了靶向ECD4的scFv和识别ECD2的Fab臂。ZW49通过蛋白酶可裂解连接子将bsAb ZW25与化疗衍生的微管抑制剂澳瑞他汀相连，DAR为2。在临床前研究中，ZW49在HER2低表达和高表达的乳腺癌细胞系以及PDX模型中均表现出增强的内化作用和抗肿瘤活性。尽管ZW49在I期临床试验中显示出可接受的安全性，但Zymeworks公司后续已优先发展其他管线资产，ZW49的临床开发已被降级，其未来策略尚不明确。此外，靶向HER2的双靶向ADC还包括DXC018和JSKN003。由杭州多禧生物开发的DXC018，在抗体设计上采用了与ZW25相同的靶向ECD4的scFv和靶向ECD2的Fab臂；在载荷设计方面，包含一种抗代谢物抑制剂和一种TOP1i，总DAR为12（两种载荷比例未公开），能有效诱导DNA损伤和细胞毒性效应。双靶向设计增强了亲和力和内化作用，而双载荷设计在多种HER2阳性肿瘤模型中表现出细胞毒性活性。JSKN003 是基于抗体KN026进行的修饰和设计，与ZW49类似，它靶向HER2的两个不同表位（曲妥珠单抗靶向ECD4，帕妥珠单抗靶向ECD2）。通过位点特异性聚糖偶联，利用可裂解的四肽连接子，通过点击化学将重链的聚糖与TOP1i偶联，DAR为3.6。I期和II期临床数据表明，JSKN003在经过大量预处理的HER2阳性乳腺癌（包括接受过T-DXd治疗的患者）中显示出有前景的疗效和可控的安全性。双表位HER2抗体设计可能增强了其结合效率，并促成了观察到的临床获益。目前，JSKN003已进入III期临床试验（NCT06079983）。 (2) 靶向MET的双表位ADC 由再生元制药开发的REGN5093-M114 是一种双表位MET ADC，通过蛋白酶可裂解连接子将双表位MET抗体与美登素类载荷M24偶联，DAR为3.2，在高MET表达的异种移植肿瘤模型中表现出良好的疗效和安全性。后续研究进一步揭示了其细胞内加工机制。进入细胞后，REGN5093-M114首先内化进入分选内体，然后快速转运至再循环内体，并逐渐到达晚期内体。有趣的是，再循环内体在不同癌细胞中贡献了高达35%的MET和EGFR ADC的加工过程，这是由定位于该区室的组织蛋白酶L介导的。临床前研究表明，REGN5093-M114不仅对常规MET高表达肿瘤有效，而且对多种耐药肿瘤，如MET或EGFR二次突变以及其他获得性突变的肿瘤也有效。目前，REGN5093-M114正在进行I/II期临床试验（NCT04982224）。 (3) 靶向FRa的双表位ADC 叶酸受体FRa参与肿瘤浸润、转移和进展，使其成为肿瘤治疗的一个有吸引力的靶点。IMGN853 是全球首个且唯一获批的靶向FRa的ADC药物。然而，IMGN853在FRa中低表达患者中疗效较差，限制了其在更广泛患者群体中的应用。为增强抗体内化能力和细胞内毒素释放效率，从而改善对FRa低表达患者的疗效，已开发出靶向FRa的双表位ADC。靶向FRa的双表位ADC IMGN151，由靶向FRa不同表位的不对称Fab-ScFv抗体和一种新型的美登素类毒素DM21组成，通过可裂解的肽连接子偶联。与前一代FRa ADC IMGN853相比，IMGN151的双表位设计增强了其与靶细胞的结合，能够更有效地递送药物分子。在体内，IMGN151也显示出显著优势，具有改善的药代动力学特性和优异的抗肿瘤疗效，目前正在进行II期试验（NCT07024784）。 近期美国癌症研究协会（AACR）的摘要也展示了两种FRa双表位ADC的临床前数据。由基因科学制药有限公司开发的GenSci140，由结合FRa不同表位的Fab和单域重链抗体（VHH） 组成，通过可裂解连接子携带TOP1i抑制剂载荷，DAR为6。它能够同时结合肿瘤细胞上FRa抗原的不同表位，并通过高效内吞进入细胞，即将进入I期临床试验（NCT07251166）。由信达生物制药开发的IBI3010，由靶向FRa的双表位抗体组成，与新型TOP1i NT1偶联，具有均一的DAR为8。据报道，在不同FRa表达水平的细胞系来源的多种异种移植模型中显示出良好的疗效和安全性。 尽管BsADC在多项研究中已显示出有前景的治疗效果，但其发展仍面临显著挑战。ZW49等候选药物的早期临床结果已提示潜在的安全风险，且多抗原靶向可能导致累积毒性。此外，某些双特异性构型增加的分子大小可能损害肿瘤穿透性，而复杂的分子设计和制造工艺也带来了额外的限制。这表明，BsADC的靶点选择和亲和力优化需要审慎考虑，同时分子设计必须平衡结构复杂性与制造可行性。尽管面临诸多挑战，BsADC的开发为下一代ADC的理性设计提供了一个关键方向。 03 内化增强型ADC ADC的基本作用机制依赖于其抗体部分与肿瘤细胞表面特定抗原结合，随后通过受体介导的内吞作用发生内化。一旦内化，ADC复合物在溶酶体中被降解，释放出细胞毒性药物，诱导细胞凋亡或死亡。因此，内吞作用是决定ADC疗效的关键步骤。目前已经开发出多种策略来提高ADC的内吞效率，例如上文提到的双表位ADC设计、靶向快速周转受体以及引入肽标签以增强内吞或溶酶体靶向。 3.1 靶向快速组成性周转靶点 除了上述靶向两种协同肿瘤抗原的双靶向策略外，另一种双特异性ADC策略是通过靶向快速周转受体来增强药物内化和细胞内转运。尽管某些肿瘤相关抗原是理想靶点，但其自身的内化效率相对较低，限制了ADC的疗效。因此，通过额外靶向一个能快速内化的受体，所得的BsADC可以 “搭便车” 利用快速周转受体的内化途径，高效地将细胞毒性载荷递送到肿瘤细胞内部，从而增强杀伤效果。许多此类靶点已被深入研究，例如CD63、催乳素受体（PRLR）和淀粉样前体样蛋白2（APLP2）。 最近的研究已确定了一些用于设计增强内吞作用的BsADC的新兴靶点（图4a），Zhang等开发了一种靶向SORT1和HER2的BsADC，用于HER2低表达的肿瘤。利用SORT1的快速内化特性，该BsADC不仅增强了在HER2低表达肿瘤细胞上的结合和内化，而且还促进了HER2的降解，在动物模型中表现出强大的抗肿瘤活性。类似地，Chen等开发了一种靶向SLC3A2和PD-L1的BsADC，利用SLC3A2（也称为CD98hc）作为靶点来增强内化。该BsADC能有效促进内化不良的PD-L1的溶酶体靶向和降解，在PD-L1低表达肿瘤模型中显示出优于单靶点ADC的抗肿瘤活性。Tsuchikama等采用了不同的策略，利用化学方法构建双特异性ADC。他们选择叶酸（FA）和精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）作为配体，分别靶向FRa和整合素，其中RGD是整合素家族受体的识别序列，而叶酸是FRa的天然配体。通过分支连接子技术构建的靶向FRa/HER2的BsADC表现出特异性结合和高细胞毒性，配备RGD肽的靶向整合素/HER2的BsADC也在整合素或HER2阳性细胞中表现出靶点特异性结合和细胞毒性。 除了上述经典内吞途径，利用非经典内吞途径也是增强ADC递送的有效策略。2021年发表的一项研究探索了靶向NOTCH3的ADC的作用机制，该研究发现当NOTCH3受体与其配体DLL4结合时，会介导NOTCH3-ADC向表达配体的相邻细胞进行转吞，这使得靶向NOTCH3的ADC不仅能杀死表达靶抗原的受体细胞，还能被递送至不直接表达靶抗原但表达其配体的肿瘤细胞，从而扩大了杀伤范围（图4b），这种具有非典型细胞毒性机制的NOTCH3-ADC在异种移植模型中显示出优于标准化疗的持续肿瘤缩小效果。另一项研究探索了通过p38介导的非经典内吞作用促进EGFR靶向ADC的细胞内递送，该研究发现尽管西妥昔单抗等抗体抑制配体诱导的EGFR内吞，但肿瘤坏死因子-α（TNF-α）或顺铂等化疗药物可通过激活p38通路强烈诱导西妥昔单抗-EGFR复合物的内吞。与该复合物相关的ADC也能被内吞，从而增强其抗增殖活性。这项研究揭示，通过药物组合诱导非经典内吞途径，可以绕过某些抗体对经典内吞的抑制作用，从而有效提高ADC的细胞内递送效率，这些非经典内吞途径的发现为ADC的设计提供了新的视角。 在最近的一项研究中，研究人员将焦点转向了受体泛素化（图4c）。Zhuang等开发了一种受体泛素化靶向ADC策略（ubitaADC），该策略将基于抗体的靶向与膜相关E3泛素连接酶的选择性招募相结合，从而将肿瘤相关受体重新引导至泛素依赖性内吞途径，以加速内化并增强ADC的溶酶体运输。以EGFR和HER2为典型靶点，他们证明该策略能够在保持高亲和力抗原识别的同时，实现对膜相关E3泛素连接酶RNF43和ZNRF3的可控接合，从而在多种结直肠癌模型中带来改善的细胞内载荷递送、细胞毒性反应和肿瘤杀伤效果。在体内，ubitaADC相比传统ADC表现出更优的抗肿瘤疗效。 降解剂-药物偶联物（DDCs）的出现为ADC的设计和开发提供了新方向。Wells等利用快速内吞物——低密度脂蛋白受体（LDLR）作为溶酶体运输效应器，开发了LDLR靶向嵌合体（LIPTACs）。LIPTACs能够选择性地、高效地降解多种膜蛋白。通过VC连接子连接细胞毒性载荷MMAE后，这种新型DDC在体外可将传统ADC的效力提高多达20倍（图4d）。Fang等提出了一种小分子-肽偶联物版本的DDC，他们利用环状五肽（RGDyK）和小分子BMS-8分别作为αvβ3整合素和PD-L1的结合基序。通过组织蛋白酶B可裂解连接子与MMAE相连后，该DDC在体外和体内均显示出有前景的抗肿瘤活性。 图4. ADC的目标是快速组织周转目标。 a. 部分BsADC靶向快速组成转换目标的示意图。b. NOTCH3靶向ADC的作用机制。c. ubitaADC原理图。d. LIPTAC原理图。 3.2 引入肽标签  细胞穿透肽（CPPs）被广泛认为是细胞内递送的促进剂，这些能够穿过细胞膜的短肽可以将治疗性分子递送到细胞内，从而提高药物的生物利用度和治疗效果。CPPs内化的详细机制尚不完全清楚。含有赖氨酸或精氨酸的阳离子CPPs聚集在带负电荷的膜表面，通过吸引水分子与脂质双层疏水核心中CPPs的带电氨基酸结合而发挥作用。除了这种直接穿透方式，CPPs也可能通过多种内吞途径进入细胞。在抗体和ADC药物研究中，CPPs可用于增强这些治疗性蛋白药物的细胞内递送效率，在癌症治疗中显示出巨大潜力。 Mier等探索了将四面体CPPs（tCPP）与抗体和ADC偶联的效果（图5）。研究发现，这种偶联技术可将抗体的细胞内摄取率提高多达四倍，同时保持其靶向特异性。当该技术应用于已获批的ADC药物恩美曲妥珠单抗（Kadcyla） 时，所得的tCPP-ADC偶联物在体外细胞毒性研究中表现出比原药高6倍的细胞毒性。然而，在体内研究中，tCPP-mAb偶联物与未修饰抗体相比，并未表现出增强的肿瘤蓄积；相反，其肿瘤富集减少，在血液中的清除更快。这些发现表明，该策略可能容易产生脱靶效应。 图5. 带有肽标记的ADC用于增强内吞作用或溶酶体靶向。 Mier等研究的带有四面体CPPs的ADC和Cai等研究的带有LSS的ADC。 类似的应用还包括溶酶体分选信号肽（LSSs），溶酶体靶向受体的内吞作用由其胞质结构域内的信号介导。大多数信号基于双亮氨酸或酪氨酸的肽基序，这些基序被网格蛋白外壳的组分识别，以确保蛋白质通过网格蛋白介导的内吞作用精确转运至溶酶体。Cai等探索了一种蛋白质标记方法，以增强纳米抗体-药物偶联物（NDCs）的溶酶体靶向性和疗效。在他们的研究中，他们通过分选酶介导的连接，将抗EGFR纳米抗体7D12的C末端标记上溶酶体分选基序NPGY（天冬酰胺-脯氨酸-甘氨酸-酪氨酸），以增强网格蛋白介导的内吞作用。用NPGY或RRRRRRRRNPGY基序标记，产生了两种NDC（7D12-MMAF-P1/P2），其溶酶体靶向特性和抗肿瘤活性显著提高（图5）。基于CPPs和LSSs，近年来开发了多种基于抗体的靶向蛋白质降解技术。GlueTAC和Pro-MPD是通过将CPP与纳米抗体结合构建的，而SignalTAC则是通过将阳离子非依赖性甘露糖-6-磷酸受体信号肽融合到IgG重链和轻链的C末端构建的。这些应用展示了化学修饰策略在扩展生物试剂适用性方面的潜力，同时非特异性结合的可能性及其潜在的脱靶毒性也为未来的研究带来了挑战。 04 增强结合 以共价方式与其靶点结合的小分子药物已重新获得巨大成功，近年来研究人员也将这一策略应用于共价蛋白药物的开发。化学工程化的共价亲和力蛋白能与靶蛋白形成稳定、持久的共价键，从而增强其与靶点的结合。共价蛋白的核心设计涉及将一个化学反应性官能团（共价弹头）整合到亲和力蛋白支架中。当亲和力蛋白识别并结合到靶蛋白上的特定位点时，该弹头会与靶蛋白表面邻近的亲核氨基酸残基（半胱氨酸、赖氨酸等）发生化学反应，形成稳定的共价键（图6a）。 硫（VI）氟交换（SuFEx） 是一种新兴的点击化学反应类型，在共价药物开发中显示出巨大潜力。Yan等通过基于SuFEx化学的马来酰亚胺取代的芳基氟硫酸盐（MFS）共价弹头的化学连接，成功开发了靶向HER2的共价亲和力蛋白-药物偶联物（图6b）。他们选择了两种常见的亲和力蛋白——亲和体（ZHER2:342）和单抗体（Adnectin） 作为靶向部分，并以铜绿假单胞菌外毒素（PE24）作为细胞毒性载荷来构建蛋白偶联物。体外实验表明，MFS-ZHER2与HER2的共价结合超过72%，细胞摄取比非共价对照组高185%。在体内实验中，与非共价亲和力蛋白药物偶联物相比，两种共价偶联物在肿瘤部位的药物富集更快、更强且更持久。 最近，他们的团队进一步开发了一种靶向HER2和EGFR的双特异性共价亲和力蛋白-药物偶联物AAA-PE24。其设计包含三个关键组成部分：一个HER2/EGFR双靶向配体部分（ZHER2:342和Adnectin） 与MFS弹头相连，一个白蛋白结合域（ABD035）以延长半衰期，以及一个PE24毒素部分以提供抗肿瘤活性（图6c）。结果显示，与单价药物相比，其共价交联性能提高了440%至630%，细胞内摄取增加了290%至340%，肿瘤滞留时间延长了360%至460%。在HER2/EGFR阳性胰腺肿瘤模型中，这种双价药物的肿瘤抑制率达到90.4%，显著优于单价或非共价药物（28.4%至66.9%）。总而言之，这些结果证明了基于SuFEx的共价策略在蛋白药物开发中的成功。共价蛋白药物可以通过MFS连接子中的芳基氟硫酸盐与靶标上亲核残基之间的邻近使能反应进行不可逆的交联，从而形成一种有前景的药物模式，具有快速肿瘤靶向、永久受体结合、有效药物蓄积和快速残留代谢的特点。 基于SuFEx的共价亲和力蛋白药物表现出更高的肿瘤富集、更持久的靶点结合能力和更强的细胞内化能力。然而，这种共价特性导致其与受体（无论是在肿瘤细胞还是正常细胞上）不可逆结合，这可能导致全身毒性，提示在后续研发中应选择更具特异性的肿瘤靶点。 图6.共价蛋白药物。 a.亲和蛋白药物及其相邻效应活化反应性治疗药物的设计示意图。b.亲和蛋白药物上的MFS连接物通过点击化学SuFEx与靶蛋白的近端亲核残基发生反应。c.共价亲和蛋白药物的结构。 05 载荷组合策略 在ADC中，载荷是直接杀死肿瘤细胞的最终效应组分，其效力、选择性和可控性决定了ADC的疗效和安全性。目前，已获批的ADC载荷包括两类微管抑制剂（澳瑞他汀和美登素类）、两类DNA损伤剂（卡奇霉素和PBD）、两类TOP1i（DXd和SN-38） 以及一种细菌毒素（PE38，2023年撤市）。然而，单载荷ADC的单一作用机制使肿瘤细胞易于产生耐药性，直接影响ADC的疗效。为克服肿瘤异质性和耐药性，载荷组合策略应运而生。双载荷ADC将两种具有相同或不同作用机制（MOA）的载荷偶联到同一抗体上，形成一种多维度、协同的肿瘤杀伤策略，从而克服了依赖单一载荷的传统ADC的局限性。尽管目前有多种组合策略正在临床研究中，包括ADC与小分子药物（化疗药或酪氨酸激酶抑制剂）联用以及两种单载荷ADC的联用，但双载荷ADC仍具有独特的固有优势。对于ADC与小分子药物联用，小分子药物全身暴露量高，与ADC的靶向同步性差，协同疗效有限，且给药方案复杂，难以实现精确的剂量匹配。双载荷ADC能够实现两种毒素分子的同步细胞内释放，且释放比例相对可控。与单载荷ADC联用相比，双载荷ADC避免了与同一抗原的竞争性结合，从而提高了递送效率。此外，在等效细胞毒性下，双载荷ADC允许每种载荷的DAR维持在较低水平，从而减少了单一毒素高剂量带来的脱靶毒性。尽管这种设计导致更大的结构复杂性和均一性挑战，并且给药灵活性低于联合疗法。 5.1 具有相同MOA的双载荷 微管抑制剂MMAE和MMAF具有互补的理化性质，MMAE的疏水性赋予其高细胞膜通透性，允许通过旁观者效应消除邻近细胞。然而，作为多药耐药（MDR）外排泵的底物，MMAE在高外排泵表达的细胞上活性降低。相比之下，MMAF受药物外排影响较小，对MDR细胞具有高杀伤活性，但细胞通透性有限。 基于这些独特特性，多项研究通过不同的连接方法设计了使用MMAE和MMAF的双载荷ADC。Senter等利用正交保护的半胱氨酸残基顺序去保护，制备了均一的MMAE/F双载荷ADC（DAR 8+8），如图7a所示。Tsuchikama等通过化学酶法偶联生成了一系列具有组合DAR为2+2、4+2和2+4的均一双载荷ADC（图7b）。他们利用MTGase介导的双功能分支连接子偶联，随后通过正交点击反应连接两个载荷模块，从而获得具有明确DAR的均一双载荷ADC。类似地，Kayser等尝试将MMAE与另一种微管抑制剂DM1 组合。曲妥珠单抗通过可裂解连接子（Val-Cit）连接MMAE，再通过不可裂解连接子（MCC）连接DM1，构建了TmaB-VcMMAE C-MCC-DM1。微管抑制剂的组合显示出比单药给药更强的疗效，并在体外和体内均表现出显著的抗肿瘤效果，证明了该策略的有效性。 近年来，我们课题组专注于蛋白质的精准偶联，开发了一系列糖基化位点特异性ADC技术，以便于天然IgG的简便修饰。在早期研究中，利用野生型内切糖苷酶的水解活性及其突变体的转糖基活性，实现了抗体糖基化的均一控制。随后，通过将野生型EndoS2与基于二糖的底物LacNAc 相结合，对ENGase催化的化学酶法策略进行了改进，以支持抗体的单步糖工程化，从而无需抗体预工程化即可将细胞毒性药物位点特异性偶联到糖基化位点。还建立了一种使用基于硫酯的酰基转移试剂的无痕策略，以支持一步法制备位点特异性ADC。通过结合这些偶联方法，在一锅反应中实现了在K248位点和保守N-糖基化位点N297上连接载荷的双位点特异性ADC。通过EndoS2催化的一步糖工程化，在糖基化位点安装了LacNAc-连接子-MMAE/MMAF载荷，并利用基于FcBP的药物底物在K248位点引入了第二个载荷（图7c）。所构建的双载荷ADC，如前所述，表现出可接受的均一性、优异的缓冲液稳定性以及增强的体外和体内效率。 同一机制的另一个例子是TOP1i的组合，它利用两种不同的依喜替康载荷：一种用于发挥旁观者活性以应对肿瘤异质性和低靶点表达，另一种用于在癌细胞中蓄积以实现更强的效力，从而最大化肿瘤特异性活性。一篇来自AACR的摘要介绍了一种新型双TOP1i ADC，他们利用曲妥珠单抗作为靶向抗体，两种不同的TOP1i作为载荷，生成了抗HER2双载荷ADC，DAR为2+2，该ADC在体内研究中显示出优异的抗肿瘤疗效，并在循环中具有出色的稳定性，无载荷丢失或连接子裂解的迹象。 图7. 具有相同MOA的双有效载荷ADC。 a. Senter等研究中报道的ADC; b. Tsuchikama等研究中报道的ADC; c. Tang等研究中报道的ADC. 5.2 具有不同MOA的双载荷 癌细胞通常对单药治疗产生耐药性，因此联合使用具有不同MOA的抑制剂有助于克服耐药机制，因为对一种药物耐药的细胞可能仍对另一种药物敏感。 (1) 微管抑制剂 + DNA损伤剂  吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮卓（PBD） 是一类在链霉菌中发现的具有抗肿瘤活性的天然产物。PBD选择性地烷基化DNA小沟，导致DNA链交联，造成DNA损伤，从而诱导细胞凋亡。Dimasi等利用三功能连接子将MMAE和PBD（SG3457）偶联到抗体的同一位点上，构建了一种双载荷ADC。该连接子包含一个用于在曲妥珠单抗上特异性结合的N-芳基马来酰亚胺，以及用于药物偶联的炔基和酮基（图8a）。所得的双载荷ADC在HER2表达的MDA-MB-453细胞中表现出显著的体外抗肿瘤效果。除了在同一连接子上偶联不同载荷外，Rader等还利用抗体不同位点上的工程化硒代半胱氨酸和半胱氨酸残基，构建了一种携带MMAF和DNA损伤剂PNU-159682的双载荷ADC（图8b）。该双药ADC对HER2表达的细胞系表现出选择性和强效的细胞毒性，并表现出与所连接药物一致的双重作用机制。PNU-159682因其DNA损伤活性导致S期细胞周期阻滞，而MMAF同时抑制微管聚合并导致G2/M期细胞周期阻滞。然而，由于这些PBD弹头的高细胞毒性，这些研究中的双载荷ADC被发现与PBD单载荷ADC效力相当，并且均比MMAE/MMAF ADC更有效。这表明，在这种设计中，细胞毒性主要由DNA损伤载荷介导。 图8.具有不同MOA的双有效载荷ADC。 a. Dimasi研究报道的ADC; b. Rader研究报道的ADC; c. Matsuda研究报道的ADC. (2) TOP1i + 微管抑制剂 Matsuda等人将微管抑制剂与TOP1i组合到同一ADC上，以增强疗效和应答持久性。第一个载荷MMAE被引入Lys248，生成DAR为2的ADC。在链间二硫键断裂后，通过硫醇-马来酰亚胺反应引入第二个载荷德鲁替康，最终DAR为10（2+8），如图8c所示。该双载荷ADC对HER2阳性细胞表现出优异的体外细胞毒性，优于T-DXd，并在NCI-N87异种移植模型中增强了肿瘤抑制作用。一篇AACR摘要中介绍了一种靶向Nectin-4的新型三价ADC，其组合了MMAE和两种不同的TOP1i，DAR为2+2+2。在Nectin-4高表达的乳腺癌SUM-190PT异种移植模型中，这种三弹头ADC导致了持久的完全肿瘤消退。而相应MMAE（DAR 2）和TOP1i（DAR 2+2）单载荷ADC的组合，在相同剂量下，未见应答。此外，该ADC在小鼠、食蟹猴和人血清中均保持优异的稳定性，无连接子-载荷解偶联或连接子裂解，DAR保持不变。 (3) TOP1i + RNA聚合酶II抑制剂  KH815 是一种靶向TROP2的ADC，是首个进入临床试验的双载荷ADC。它采用半胱氨酸和N297偶联技术，整合了TOP1i抑制剂依喜替康和RNA聚合酶II抑制剂雷公藤甲素，平均DAR约为7.5（4+3.5）。依喜替康通过马来酰亚胺连接子和二肽可裂解连接子随机偶联到KH815的半胱氨酸上，而雷公藤甲素则通过带有二苯并环辛炔基团的四肽连接子连接到N297位的修饰糖基上。体外和体内稳定性研究显示，雷公藤甲素从抗体骨架上的释放速率显著高于依喜替康。含雷公藤甲素的ADC分子半衰期为22.6小时，而含依喜替康的ADC分子半衰期约为56.2小时。KH815的双重作用机制能够同时抑制RNA合成和诱导DNA双链断裂，在体外和体内异种移植小鼠模型中，与其他TOP1i-TROP2靶向ADC相比，在相同或更低剂量下表现出更强的抗肿瘤活性。此外，KH815已显示出克服TOP1i-ADC耐药的潜力。目前，KH815正在进行I期临床试验（NCT06885645）。 (4) TOP1i + DNA损伤反应抑制剂（DDRi）  由TOP1i诱导的复制应激所激活的DNA损伤反应（DDR）通路已被确定为TOP1i不敏感的重要驱动因素。因此，同时抑制TOP1和DDR可能克服耐药性，使肿瘤对TOP1i更敏感。共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶（ATR） 是DDR中的关键调控因子，已成为一个极具潜力的组合靶点，其抑制对肿瘤细胞表现出选择性毒性。HMBD802（也称为CLIO-8221） 是一种新型抗HER2双载荷ADC，组合了TOP1i和ATRi载荷。通过MTG介导的生物偶联，将专有连接子锚定到抗HER2抗体上，然后通过点击反应连接TOP1i和ATRi载荷，生成DAR为4+4的双载荷ADC。HMBD-802在多种T-DXd敏感细胞系中表现出优异的体外疗效，并在T-DXd耐药异种移植模型中实现了肿瘤细胞杀伤。目前，HMBD-802正在进行I/II期临床试验（NCT07300943）。 在最近的一项研究中，Meng等设计了一种用于可编程药物组合的多载荷ADC架构（图9）。T1000 是一种稳定的连接子，由二肽VA连接子和经聚肌氨酸（10个单位）修饰的自牺牲间隔基对氨基苄醇组成。将多T1000载荷（MTP）直接偶联到天然抗体上，或将两种MTP组合地、顺序地偶联到抗体的工程化和天然半胱氨酸上，可实现协同载荷-抗体比例偶联物（SPARCs）的可编程组装，其带有2-6个载荷，总DAR高达30，载荷比例可从1到10调节。与单TOP1i ADC与游离药物联用相比，他们构建的组合了TOP1i与DDRi的SPARC表现出更优的疗效和改善的安全性，降低了血液学毒性，并同步改善了载药制剂的药代动力学。 图9.SPARC的设计。 孟等设计了一种多负载ADC架构SPARC，并在SPARC中结合了TOP1i和DDRi。 5.3 与免疫调节剂组合的策略  治疗性刺激先天免疫细胞可以诱导抗肿瘤反应并克服免疫治疗的耐药性，多种先天免疫受体的激动剂，如Toll样受体（TLRs） 和干扰素基因刺激因子（STING），已被证明具有强效的免疫调节活性，并能够促进癌症治疗。免疫刺激抗体偶联物（ISACs） 通过将抗体与免疫激动剂结合，利用抗体的靶向能力将免疫激动剂直接递送至肿瘤或特定靶点，从而改善免疫抑制性肿瘤微环境、增强抗肿瘤效果并减少全身副作用。尽管ISACs面临显著的转化障碍，如强免疫原性、高毒性以及抗药物抗体的产生，但这种协同免疫治疗的组合策略仍具有巨大的发展潜力。 双载荷ADC能够将细胞毒素和免疫刺激剂整合到单个分子中，旨在通过作为免疫激活剂激活免疫系统，为肿瘤缩小创造条件，实现协同效应。Liu等开发了一种双载荷ADC，将传统细胞毒性载荷MMAF与免疫调节型TLR7/8激动剂咪喹莫特（IMQ） 组合在CD276 mAb上，通过诱导肿瘤细胞死亡和刺激免疫细胞浸润来实现抗肿瘤效果。他们通过使用再桥接DBM连接子将mAb与MMAF连接，随后使用膦-叠氮连接子进行IMQ偶联，构建了ADC（CD276 mAb-MMAF/IMQ）。对于通过位点特异性偶联的MMAF，DAR值为3到4；而IMQ的随机偶联则显示出具有DAR为7到14的非均一结构（图10a）。所构建的双载荷ADC对CD276阳性肿瘤表现出高特异性、有效的肿瘤细胞死亡、明显的免疫细胞浸润以及肿瘤微环境中的细胞因子分泌。所有动物研究中的肿瘤负荷均显著减少，突显了其作为三阴性乳腺癌（TNBC）靶向治疗的巨大潜力。 Meng等也构建了免疫刺激性SPARCs，组合了TOP1i和TLR7激动剂1V209（图10b）。在HER2同基因小鼠模型hHER2-MC38中，这种新型双载荷ADC（SPARC2-HER2-exatecan-1V209） 导致小鼠的反应增强，效果优于携带单一载荷1V209或依喜替康的ADC。此外，一些研究探索了TOP1i与不同TLR7/8激动剂的组合，尽管具体结构尚未公开。这些双载荷ADC通过协同作用机制，在体外和体内均能促进增强的免疫原性细胞死亡和抗肿瘤反应，证明了这种组合策略的有效性。 此外，ADC的载荷不仅限于细胞毒性药物。近年来，已探索了多种新型偶联物，如抗体-放射性核素偶联物（ARC）、抗体-细菌毒素偶联物（ATX）、抗体-siRNA偶联物（AOC）、抗体-细胞偶联物（ACC）和降解剂-抗体偶联物（DAC）。这些新型偶联物可能解决传统疗法靶向性低和脱靶毒性高的问题，展现出广阔的发展前景。 图10.带有免疫调节剂的双载荷ADC。 a. Liu等研究中的ADC; b.孟等研究中的ADC. 通过双特异性靶向、优化的内化效率、共价结合技术和组合载荷设计等策略，这些新型ADC为精准癌症治疗提供了通用且有前景的解决方案。此外，还出现了多种功能增强的设计策略，包括前体药物偶联物以提高靶向特异性、Fc工程化以调节抗体效应功能或延长半衰期、纳米颗粒-ADC杂合物和多功能递送系统以改善递送和效率，以及近期开发的载荷再循环ADC技术以减少游离载荷毒性。尽管仍存在免疫原性、耐药性和组织特异性调控等挑战，ADC的发展正处于变革性增长的边缘，并有望重塑癌症治疗的格局。随着对肿瘤生物学的深入理解和ADC设计的持续优化，我们正朝着实现真正有效、安全和个性化的癌症治疗迈进，最终为难治性恶性肿瘤患者带来新的希望。 Ref: Recent advances in function-enhanced antibody-drug conjugates: Antibody optimization and payload combination.Acta Pharmacologica Sinica. 2026, 0:1–17. https://doi.org/10.1038/s41401-026-01867-w 免责声明：推文基于已公开的资料信息撰写，仅用于知识分享和传递，任何情况下本文的信息或所表述意见均不构成对任何人的建议。如因版权等存在疑问，请于本文刊发30日内联系本公众号删除，更多精彩内容欢迎关注和分享公众号。