GPR132

摘要：疫苗用于控制动物的传染病。与其他类型的疫苗接种（如活疫苗、减毒或灭活疫苗）相比，基于mRNA的疫苗具有显著优势。由于只使用病原体遗传物质的一小部分，且mRNA疫苗的剂量率低，病原体逆转自身的可能性最小。为了传递mRNA疫苗，需要一种载体或运输工具来保护mRNA疫苗免受宿主细胞RNases的侵害。临床试验表明，mRNA疫苗在对抗影响动物的各种传染病（包括病毒性和寄生虫性）方面有效，能够诱导细胞介导的免疫反应和体液免疫反应，这些疾病包括狂犬病、口蹄疫、弓形虫病、寨卡病毒、利什曼病和COVID-19。当前的综述旨在强调mRNA疫苗在动物病毒性和寄生虫性疾病中的应用。 1.引言 疫苗用于控制和预防动物传染病的出现。由于疫苗的广泛使用，一些疾病如天花和小反刍兽疫已从世界中完全根除，许多其他疾病的发病率在全球范围内大幅降低。通过疫苗接种，天花和小反刍兽疫等疾病已从世界中根除，这是疫苗接种成功的故事。传统疫苗开发方法为动物的许多传染病和人畜共患病提供了持久的保护，此类疫苗的例子包括灭活疫苗、活减毒疫苗、灭活疫苗或亚单位疫苗。然而，通过这些传统方法未能预防或充分控制的疾病需要新的方法来开发疫苗，特别是针对那些更能欺骗和逃避宿主适应性免疫反应的病原体。对于病毒疫苗的开发，主要障碍是快速开发和大规模制剂及其部署，而不是传统方法的有效性。同样，传统疫苗开发方法对于非传染病（如癌症）也不适用。由于这个原因，迫切需要开发更有效和广泛适用的疫苗平台。 传统疫苗方法的有希望和有效的替代方法是使用mRNA疫苗。目前，许多技术和研究发明使mRNA疫苗成为预防和控制动物工业中许多病毒和寄生虫疾病的有效工具。使用mRNA疫苗有几个好处，如（i）安全性；感染逆转和插入突变的潜在风险最小，是一种非整合性和非感染性方法。抗原修饰减少了mRNA的免疫原性并增强了其安全性。（ii）有效性；mRNA疫苗的稳定性和翻译可以被修改，从而通过将mRNA分子制剂到载体分子中，可以实现mRNA在宿主细胞质中的快速吸收和表达。由于其最小的遗传物质，mRNA可以避免抗载体免疫，并且可以重复接种。（iii）生产；mRNA疫苗可以快速大规模生产。 细胞质含有RNases（酶），这些酶迅速降解裸露的mRNA。因此，也开发并使用了一种转染试剂用于mRNA疫苗，它保护疫苗遗传物质免受RNases的侵害，并促进mRNA被细胞吸收。一旦进入宿主体内，当mRNA到达细胞质时，核糖体（细胞翻译机制）开始从mRNA产生蛋白质，翻译后，这些新合成的蛋白质经历翻译后修饰，从而产生完全功能性和正确折叠的蛋白质（图1，使用Biorender创建）。这种mRNA药理机制使其对需要跨膜或细胞质蛋白的疫苗和蛋白质替代疗法有利。必须将这些蛋白质正确地输送到其功能位点。完成工作后，这些mRNA被宿主细胞的正常生理机制降解。 图 1. mRNA疫苗（纳米颗粒）在宿主细胞中的呈现和抗原翻译 通过动物中自我复制的纳米颗粒RNA疫苗的免疫接种，可以引起对各种传染病的强烈免疫反应（T细胞和B细胞）。在体内，mRNA的载体包括含有可离子化的氨基脂质的纳米颗粒，这些被认为是此目的的最佳选择。含脂质mRNA疫苗的最佳解剖部位是皮内途径，因为皮肤中存在大量异质免疫细胞。这种含脂质mRNA纳米颗粒疫苗的特性优于其他形式的疫苗。 2.mRNA疫苗引起的免疫反应 在过去疫苗开发过程中，各种形式（灭活或活减毒）疫苗的作用机制是未知的。然而，通过活减毒疫苗在动物、细胞系或不利生长条件下的开发，以及灭活或灭活疫苗在控制动物（牛瘟、猪瘟和马传染性贫血）和人类（麻疹、腮腺炎、天花、脊髓灰质炎和风疹）的传染病方面取得了成功。分子生物学理论和技术的进步导致了对疫苗机制的广泛了解，例如灭活疫苗产生抗原特异性抗体，而活减毒疫苗引起宿主的体液免疫反应，这对根除细胞内病原体是必要的。RNA基非病毒疫苗的免疫接种刺激了滤泡辅助T细胞和生发中心B细胞的产生（图2，使用Biorender创建）。这些疫苗模仿活微生物的疫苗接种或感染。 图2. mRNA疫苗接种引发的先天和适应性免疫反应。(1) 当mRNA疫苗被接种时，RNA感受器识别疫苗颗粒并激活先天免疫反应，导致干扰素和细胞因子的产生。(2) 这些干扰素和细胞因子促进树突状细胞的成熟，这些细胞迁移到淋巴结以呈现感兴趣的抗原。(3) 在淋巴结中，由树突状细胞启动T细胞和B细胞。树突状细胞激活T细胞。辅助性T细胞促进产生抗体的浆细胞的成熟。辅助性T细胞和细胞因子共同促进B细胞分化为记忆B细胞。(4) 细胞免疫和体液免疫被激活，免疫细胞向感染的组织或细胞移动。(5) 被病毒感染的细胞受到抗原特异性T细胞的攻击。(6) 通过抗体中和病毒。 mRNA疫苗引起的免疫反应机制仍需进一步阐述。mRNA疫苗被细胞受体感知和激活细胞受体的过程尚不清楚。细胞内有两种受体参与识别和诱导免疫反应，即内体性Toll样受体（TLRs）和视黄酸诱导基因I（RIG-I）样受体（RLRs）。TLRs进一步细分为TLR-3、TLR-7、TLR-8和TLR-9，它们存在于单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞中。TLR-3参与识别包括由单链RNA（ssRNA）产生的45个以上碱基对的双链RNA（dsRNA），而富含鸟苷、尿苷或多尿苷的RNA由TLR-7和TLR-8激活。TLR-8只能与ssRNA结合，而TLR-7可以与ssRNA和dsRNA结合，并增强抗原呈递、细胞因子分泌和B细胞免疫反应刺激。内体TLR-9受体参与抗原呈递细胞，并作用于激发宿主的免疫反应。 RIG-I样受体作为模式识别受体，RLR家族的其他成员包括黑色素瘤分化相关蛋白5（MDA5）和遗传学和生理学实验室2（LGP2）。RIG-1参与识别ssRNA和dsRNA，最终导致干扰素的产生，而MDA5存在于细胞质中，参与识别病毒RNA复制期间产生的长dsRNA。mRNA疫苗刺激了先天免疫。 mRNA疫苗接种激活了先天免疫系统和适应性免疫系统。mRNA疫苗激活宿主适应性免疫反应，增强了细胞因子和干扰素的产生，这些因子参与了免疫防御细胞的招募，即自然杀伤细胞、巨噬细胞和树突状细胞。先天免疫系统损害了抗原的表达，从而降低了疫苗的有效性。有一份报告指出，当IFN拮抗剂与mRNA疫苗一起使用时，观察到疫苗的相当大的效果。因此，为了避免先天免疫系统（例如mRNA的修饰）的过度反应，必须共同给予拮抗剂，以维持疫苗的有效性。 3.动物传染病的mRNA疫苗开发 疫苗被认为是控制和预防人类和动物传染病最成功的预防性和治疗性工具（见表1和表2）。疫苗可以挽救成千上万的动物和人的生命，并节省资金。由于疫苗接种，麻疹、脊髓灰质炎和小天花等严重传染病已被根除或接近根除，许多其他疾病的发病率和死亡率也大幅降低。 3.1.口蹄疫 口蹄疫是一种由口蹄疫病毒（FMDV）引起的有蹄动物的传染性病毒疾病，在发展中国家和不发达国家尤为常见。根据抗原和遗传属性，FMDV有O、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3七个血清型。尽管口蹄疫的死亡率很低，但FMD的爆发会导致严重的经济损失，并对活体动物及其产品的国内外贸易产生负面影响。病毒的传播方式是通过气溶胶、直接接触感染动物、通过污染物、人类和其他非敏感动物。无口蹄疫国家通过严格的检疫和限制从口蹄疫流行国家进口敏感动物及其产品来维持这一状态。在控制家畜（牛、水牛、绵羊和山羊）中的FMD方面，最有效的方法是限制感染动物及其产品从其所在地向健康易感动物的流动，屠宰暴露和感染的动物，消毒受污染的地方和设备，以及接种疫苗。 表1：针对传染病的mRNA疫苗 表2：mRNA疫苗对动物和人类传染病的免疫反应 目前用于控制和预防FMD的传统疫苗通过激活先天免疫反应和适应性免疫反应来诱导保护。这些疫苗不提供长期保护，需要多次加强剂量来维持群体中足够的免疫水平。这些传统疫苗也有一些缺点，如基因毒性潜力、较低的细胞免疫、较短的保护期限，以及在接种和感染动物之间难以进行血清学区分。为了克服所有这些问题并在过去十年中开发更安全的下一代FMD疫苗，进行了许多尝试。2010年，进行了一项研究，阐述了在小鼠中由mRNA FMDV（基因工程）诱导的免疫，并证明它可以在实验室动物中引起强烈的免疫反应。这为开发基于mRNA的疫苗提供了可能性，以实现对动物自然感染的长期保护。口蹄疫病毒对干扰素（IFN）敏感。因此，Rodriguez-Pulido及其同事进行了一项研究，表明FMDV的dsRNA可以在IBRS-2（猪肾细胞系）和新生小鼠中引起免疫反应，并且体外转录RNA对预防FMD的有效性。结果表明，3'非编码区的dsRNA在SK-6细胞系中诱导了强大的IFN alpha/beta激活。进一步，这种dsRNA在新生小鼠体内也证实了自然免疫反应的诱导。这认识到dsRNA具有开发针对动物FMDV疫苗的潜力。同一组研究了对应于内部核糖体进入位点的非感染性RNA作为FMD疫苗设计的佐剂的潜力，当它与常规疫苗一起增强了小鼠对FMDV挑战的免疫反应时。此外，Rodriguez-Pulido及其同事分析了合成非感染性RNA在猪中的免疫调节效应。这项研究证明了这些RNA分子与常规疫苗共同给予可以增强针对FMDV的特异性抗体滴度。此外，FDMV能够与宿主细胞发生突变和重组。病毒与宿主细胞的重组可能比单独的非活性病毒引起更强的免疫反应。宿主细胞中存在的酶（RNAses）在它们进入细胞后如果不适当修饰和/或通过封装（加帽）保护，会迅速降解裸露的RNA。同样，在反向遗传过程中，体外合成的RNA也会被酶降解。Semkum及其同事建立了一个DNA载体pKLS3（FMDV的小型基因组），它最小化了RNAses对合成mRNA的降解。它可以用来驱动FMDV感兴趣的基因的转录，因为它包含转录和翻译病毒所需的最小顺式作用组分。用于生产疫苗的mRNA是在体外转录的，编码特定的抗原。pKLS3有潜力用作转录系统，用于表达mRNA，可能在生产基于mRNA的疫苗中有用。对于FMD疫苗（基于mRNA）的开发，现有信息提供了一个有希望的途径。 3.2.狂犬病 狂犬病是由狂犬病病毒引起的病毒性疾病，可以感染所有温血动物，包括人类。它是一种人畜共患病，每年大约有60,000人因狂犬病病毒感染而死亡。超过95%的狂犬病病例是由狂犬动物的咬伤引起的，特别是狂犬狗的咬伤。这是一种严重的病毒性疾病，以急性脑炎为特征，通过狂犬动物的咬伤或通过与狂犬动物的唾液接触粘膜从狂犬动物传播给人类和其他易感动物。病毒通过表面糖蛋白（狂犬病病毒糖蛋白）附着在其细胞受体上，并沿着周围神经传播到大脑。为了预防狂犬病，早期疫苗是在哺乳动物的神经组织中生产的，但后来被胚胎蛋和组织培养中开发的疫苗所取代。全世界都需要一种负担得起且有效的狂犬病疫苗，因为目前可用的疫苗由于某些限制（如生产能力、储存要求、成本和接种时间表）无法满足需求。以前为了开发狂犬病疫苗，使用了多种不同的病毒疫苗生产方法。CureVac®应用的新概念是使用mRNA编码主要的狂犬病病毒抗原狂犬病病毒糖蛋白（RABV-G）。在研究mRNA疫苗对狂犬病的免疫反应的第一阶段临床试验中，选择了疫苗候选物（CV7201）。CV7201证明可以诱导保护性免疫反应，这受到疫苗剂量和接种途径的影响。阳离子蛋白鱼精蛋白被用作CV7201中编码狂犬病病毒糖蛋白抗原的热稳定mRNA的稳定剂。与传统的商业灭活狂犬病病毒疫苗相比，mRNA疫苗诱导了更好的免疫反应，通过促进合成病毒中和抗体，这些抗体对保护是必要的。在第一阶段试验中，发现需要高剂量的狂犬病mRNA疫苗才能提供显著的抗体滴度以保护。为了降低狂犬病疫苗（CV7201）的剂量率，采用了一种新方法，即使用脂质纳米颗粒（LNPs）包裹mRNA抗原。这项临床试验表明，mRNA疫苗是安全的，其反应原性概况可能是可以接受的，这种技术形式比传统疫苗提供了许多优势。同样，在接种编码RABV-G的mRNA的家猪和老鼠中确认了中和抗体的产生。RABV-G mRNA疫苗诱导了CD4+和CD8+的产生，并提供了对脑内致死性感染挑战的保护。这项研究表明，编码RABV-G的基于mRNA的疫苗在小型和大型动物中是可行的，并且可能是控制动物病原体疾病的有希望的方法。 3.3.利什曼病 利什曼病是由雌性白蛉沙蝇叮咬传播的一种寄生虫性人畜共患病。引起该病的病原体是利什曼属（L.）的原生动物寄生虫。该病有不同形式，最常见的包括由不同种类引起的内脏利什曼病、皮肤利什曼病和粘膜皮肤利什曼病，如L. donovani、L. chagasi、L. infantum、L. braziziliensis、L. maxicana和/或L. archibaldi。狗是宿主，而人类是偶然宿主。第一代和第二代疫苗都是为了预防人类疾病而开发的，但缺乏完全保护。为了更好地提供保护，正在考虑基于mRNA的疫苗。Savar等人设计了两种组合的融合蛋白（LmSTI1-PpSP15和PpSP15-LmSTI1）用于疫苗开发。融合蛋白包括L. major的应激诱导蛋白1（LmSTI1）和来自白蛉沙蝇（PpSP15）的SP15。这种组合还基于alphavirus-derived self-amplifying mRNA以病毒复制子粒子的形式在in silico研究中设计。in silico分析显示了抗原组合的有效性。后来使用基于自复制mRNA（SAM）的疫苗在细胞系Baby Hamster Kidney成纤维细胞（BHK-21细胞）中表达了融合蛋白。结果表明，使用SAM载体的PpSP15-LmSTI1表达水平很高。同样，研究了其他融合重组抗原（LEISH-F2和LEISHF3+）对L. donovani的影响，采用异源主要增强方案进行免疫。C57BL/6和TLR7−/−小鼠接种了表达LEISH-F2抗原的RNA基疫苗，随后接种了亚单位疫苗。结果表明，单独使用RNA基疫苗的免疫（同源免疫）没有提供显著的保护。然而，当小鼠使用异源方案的增强剂免疫时，产生了强大的抗原特异性T细胞反应（CD4和CD8），并对细胞内寄生虫提供了显著的保护。需要进一步研究以识别新抗原并开发有效的针对利什曼病的基于mRNA的疫苗。 3.4.弓形虫病 弓形虫是一种专性细胞内原生动物，负责所有温血动物的弓形虫病。它的复杂生命周期包括在确定宿主（猫科动物）中的性繁殖和在中间宿主（猫和其他温血动物）中的无性繁殖。全球大约有一半的人类被弓形虫感染，但这种感染的流行率在不同国家之间变化，从10%到80%不等。人类可以通过食用未煮熟的肉类中的组织囊肿或污染食物中的卵囊偶然获得这种感染。主要为了保护免受弓形虫感染，免疫依赖于由CD4+和CD8+介导的细胞免疫反应，并最终刺激细胞因子（伽马干扰素）的分泌。除此之外，体液免疫也在限制弓形虫病方面发挥重要作用，通过抗弓形虫抗体抵抗寄生虫的入侵，通过调理作用促进寄生虫的吞噬作用，并最终激活经典补体途径。Chahal等人最近开发了一种完全合成的树突状纳米颗粒疫苗，其中包含封装的mRNA复制子编码抗原，这些抗原能够引发免疫反应并提供对弓形虫感染的保护。这种mRNA复制子同时编码六种抗原，如密集颗粒蛋白6（GRA6）、棘蛋白18（ROP18）、棘蛋白2A（ROP2A）、表面抗原1（SAG1）、顶端膜抗原1（AMA1）和表面抗原2A（SAG2A）。这是一种完全保护性的单剂量mRNA疫苗（mRNA复制子纳米颗粒），用于预防和控制弓形虫。尽管如此，它可能需要时间才能商业化。Luo等人分析了小鼠中针对弓形虫挑战的自复制RNA疫苗的活性，该疫苗编码核苷酸三磷酸水解酶-II（NTPase-II）。进一步，他们评估了疫苗与脂质纳米颗粒的联合效应。小鼠的免疫接种结果产生了强大的免疫反应。细胞和体液免疫反应都被激发，产生了高特异性抗弓形虫抗体和IFN-γ。与对照组相比，接种疫苗的小鼠大脑囊肿减少了62.1%，并显著延长了动物的存活时间。现有信息为生产预防弓形虫病的mRNA疫苗提供了一个有希望的途径。 3.5.寨卡病毒病 寨卡病毒最初是在1947年从乌干达寨卡森林的一只哨兵恒河猴的血液中分离出来的。该病毒通过蚊子（埃及伊蚊）的叮咬传播。它具有人畜共患的重要性，是神经和胎儿异常（如脑钙化、小头症、听力和视力丧失）的罪魁祸首。最初，它与轻微的发热症状相关。然而，它传播到美洲和太平洋岛屿，导致严重的后果，如吉兰-巴雷综合征、先天性寨卡综合征和自然流产。最近，它已成为一种流行病，因此，需要开发一种有效且安全的疫苗。已表明有多种类型的疫苗可以保护非人灵长类动物和小鼠，如灭活疫苗、亚单位疫苗和/或基于腺病毒的疫苗。然而，开发一种针对寨卡病毒的有效且安全疫苗仍然是必要的。Essink及其同事评估了两种先前开发的基于mRNA的疫苗mRNA-1325和mRNA-1893在人类中的安全性和免疫原性。mRNA-1325脂质纳米颗粒包裹是第一代疫苗，编码来自2007年密克罗尼西亚寨卡病毒分离株的前膜（prM）和包膜E结构蛋白，即prME。而mRNA-1893是第二代疫苗，编码来自寨卡病毒（RIO-U1）分离株的相同蛋白prME。RIO-U1寨卡病毒是从巴西感染寨卡病毒的孕妇尿液中分离出来的。mRNA-1325和mRNA-1893疫苗的prME中分别有一个和五个氨基酸残基的差异。在小鼠的临床前研究中，编码prME的修饰mRNA疫苗显示出有希望的结果，并保护小鼠免受寨卡病毒挑战。在成年人类的第一阶段临床试验中，研究了两种mRNA疫苗的不同剂量反应。两种疫苗都被所有健康志愿者很好地耐受，并且没有向疫苗传达严重的不良反应。由于只有一个氨基酸残基，mRNA-1325的寨卡病毒特异性中和抗体（nAb）反应较差。另一方面，由于五个氨基酸残基，mRNA-1893疫苗以较小的剂量引起了强大的nAb反应，与mRNA-1325相比。所获得的结果是有希望的，Essink及其同事向第二阶段临床试验迈进。然而，为了检查疫苗的有效性，将需要第三阶段的临床试验。 3.6.冠状病毒病 许多动物种类，包括人类，都可能被冠状病毒感染。对兽医重要的冠状病毒包括猪传染性胃肠炎病毒、牛冠状病毒和禽传染性支气管炎病毒。目前，冠状病毒被认为是一种新兴病原体，负责动物和人类的急性和慢性感染，包括肠道、呼吸和中枢神经系统。2003年，由于严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）在人类中爆发，震惊了世界。2012年至2016年，在阿拉伯半岛，由于名为中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的冠状病毒，人类中报告了几次爆发。该病毒在中东和非洲的骆驼中流行。近年来，全球大流行感染了呼吸系统的冠状病毒病2019（COVID-19），由一种名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的传染性病原体引起，它起源于蝙蝠。世界卫生组织宣布COVID-19是重大的公共卫生紧急情况。对于鸡来说，为了预防由传染性支气管炎病毒引起的传染性支气管炎病，有许可的疫苗可用。然而，对于预防其他动物的冠状病毒病，开发一种安全有效的疫苗是一个未满足的需求。对于COVID-19疫苗的开发，采用了几种方法，如灭活病毒、活减毒、重组蛋白、腺病毒载体、流感病毒载体、DNA和mRNA疫苗。mRNA疫苗方法是COVID-19预防的一场变革。一种编码刺突蛋白的自复制mRNA疫苗在小鼠中提供了针对SARS-CoV-2的保护。编码刺突蛋白三聚体受体结合域的RNA疫苗针对几种SARS-CoV-2变体在恒河猴和小鼠中显示出显著的保护。BioNTech和辉瑞合作开发了一种基于mRNA的SARS-CoV-2疫苗。BNT162b2编码病毒刺突糖蛋白的全长。这是美国FDA批准的疫苗，在16岁及以上的人中两剂间隔21天的效力为95%，在随后的六个月，其效力变为91.3%。Moderna还开发了一种基于mRNA的疫苗（mRNA-1273），编码病毒融合刺突蛋白的全长。在18岁及以上的个体中，两剂间隔28天的第三阶段临床试验的效力为94.1%。 4.mRNA疫苗的类型 中心法则表明，mRNA在翻译（DNA编码蛋白）和由细胞质中的核糖体合成蛋白之间处于中心位置。目前，有两种主要类型的mRNA用于mRNA疫苗的开发，即自复制mRNA或复制体mRNA疫苗和非复制mRNA或非复制mRNA。在自复制mRNA疫苗开发方法中，mRNA编码抗原以及病毒RNA的复制机制保持不变，这使得mRNA可以在细胞内自我复制，从而实现丰富的蛋白表达。而在非复制mRNA疫苗开发方法中，mRNA仅编码感兴趣的基因，其中包含5'和3'的非翻译区。 4.1.自复制mRNA疫苗 在自复制mRNA疫苗中，感兴趣的抗原取代了阿尔法病毒基因组的结构蛋白，但RNA的复制机制保持不变。通过使用自复制mRNA，可以通过最小剂量的抗原编码RNA翻译，向宿主细胞传递大量的抗原。当自复制mRNA进入细胞质时，它与宿主核糖体结合产生非结构蛋白1（nsP1）、nsP2、nsP3和nsP4。它们是依赖核糖核苷酸的RNA聚合酶的组成部分。病毒蛋白酶（nsP2）进一步将这些蛋白质调节成单个蛋白质。这些蛋白质发挥许多重要作用，例如nsP1在建立RNA复制复合体和质膜复制复合体之间的联系方面的作用，nsP2作为蛋白酶和解旋酶，nsP3介导宿主-病毒与蛋白质的相互作用，nsP4是一种依赖RNA的RNA聚合酶。在编码区域基因组中，生成病毒RNA，表达病毒蛋白，并包装病毒基因组。自复制mRNA疫苗具有许多优点，包括由于能够自我复制而具有高表达水平，缺乏结构病毒蛋白基因，以及能够持续长达两个月。除了它们更大的尺寸和无法耐受各种合成修饰之外，还有一些缺点。 4.2.非复制mRNA疫苗 非复制mRNA疫苗包含编码感兴趣的蛋白，而不是像自复制mRNA疫苗那样需要mRNA复制的蛋白。非复制mRNA的基本结构与天然mRNA相同，包括5'帽子、聚(A)尾部、5'不饱和区、3'不饱和区，以及编码感兴趣基因的区域。5'和3'不饱和区元素在mRNA分子的稳定性和复制中起着至关重要的调节作用。5'是mRNA稳定性的重要元素，促进蛋白合成。聚(A)尾部具有保护功能，防止mRNA分子被RNases外切核糖酸酶降解。非复制mRNA疫苗的优点包括相对较小的尺寸（大约2-3 kb），与自复制mRNA疫苗（10 kb）相比，只携带所需的感兴趣基因，防止了任何其他可能导致宿主内不需要的免疫反应的蛋白表达，并且其构建容易。而缺点包括不稳定、半衰期短和表达水平低。 5.mRNA疫苗的配方和传递 mRNA疫苗的配方和传递系统决定了宿主细胞内抗原的表达效果和持续时间，以及它们引起的免疫反应的效力。mRNA分子的物理化学性质，如负电荷和大尺寸，使它们（裸露的mRNA）难以穿过细胞的质膜。模式识别受体可以轻易识别外源mRNA，并通过干扰素导致裸露mRNA的降解。因此，为了增强mRNA的细胞摄取和它们对核酸酶降解的抵抗力，需要一个传递载体。用于mRNA管理的传递载体包括树突细胞（体外）、电穿孔和基因枪（物理传递）、基于聚合物的传递和基于纳米颗粒的传递工具（LNPs）。LNPs是其中最有效和广泛使用的传递载体。 在体外，转录系统可以用来生产合成mRNA。这个转录系统由编码mRNA的DNA模板、噬菌体RNA聚合酶、RNA和合成帽子类似物组成。在某些情况下，也可以使用来自癌细胞的完整RNA用于疫苗。体外提取的mRNA或从肿瘤细胞获得的mRNA可以裸露或与载体一起管理。mRNA疫苗携带编码抗原的转录物进入宿主细胞，在那里使用宿主的翻译机制来产生抗原，然后刺激宿主的免疫系统。mRNA的细胞内稳定性和翻译效率很大程度上受其结构的影响。合成mRNA的设计基于真核RNA蓝图，在5'端有一个帽子，在3'端有一个聚A尾部。通过添加3'和5'非翻译区，可以进一步增强其稳定性和效力。这些非翻译区包含调节元素。 当mRNA疫苗被配制在脂质纳米颗粒中时，可以增强免疫反应，这也保护了mRNA免受细胞质RNases的侵害。由于其某些好处，如易于准备、毒性较小，以及能够被宿主细胞机制降解，脂质纳米颗粒长期以来被用作药物载体。脂质纳米颗粒有四个组成部分，如阳离子脂质（可离子化）、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇。由于RNA是带负电荷的分子，它与带正电荷的阳离子脂质颗粒形成复合物。脂质颗粒的可离子化特性使复合物无毒，并在宿主生理pH下保持中性或轻微带正电荷的表面。这种特性还通过最小化非特异性细胞表面脂质和蛋白质之间的相互作用，促进mRNA释放到细胞质中。还有许多其他mRNA传递系统，如精蛋白、脂质复合物、多聚体纳米颗粒、胶束复合物纳米颗粒、脂多聚体，以及阳离子纳米乳液。 6.未来展望 在人类中接种mRNA疫苗所取得的成功结果为mRNA基础疫苗在兽医医学中的发展打开了大门。目前，只有少数mRNA疫苗在动物中针对其自然宿主的特定传染病进行了研究。全球寄生虫和病毒感染对动物健康和工业家畜生产构成重大威胁。全球最严重的病毒感染缺乏适当的预防策略，包括牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、口蹄疫病毒（FMDV）、疙瘩皮肤病病毒（LSDV）、牛白血病病毒（BLV）、小反刍兽疫病毒（PPRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、非洲猪瘟病毒（ASFV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）等。传统疫苗对上述许多疾病安全有效，但仍需要研究以更好地预防疾病。对于传染病疫苗的开发，mRNA有潜力解决疫苗学中出现的许多挑战。在未来，疫苗不仅用于预防措施，还用于预防、控制和治疗动物和人类的癌症和肿瘤。 非洲猪瘟病毒是导致猪的高死亡率和出血的原因。中国是最大的猪肉生产国，由于缺乏有效的策略，这种疾病传播到许多其他国家，导致2019年约有七百万头猪死亡。目前，使用活减毒疫苗进行控制。活减毒疫苗的开发需要猪骨髓细胞或肺泡巨噬细胞，这既耗时又成本高昂。作为这种方法的替代方案，最近通过iVAX（计算疫苗设计平台）识别了非洲猪瘟病毒编码蛋白中的T细胞表位。在细胞免疫反应中，T细胞执行重要功能，参与在识别病毒的T细胞表位后直接杀死病毒感染的细胞。因此，为了充分利用T细胞表位的潜力，需要进一步调查以促进mRNA疫苗（针对T细胞）的开发。 猪繁殖与呼吸综合征病毒是导致母猪繁殖失败和仔猪呼吸道疾病的原因，影响猪农经济。PRRSV有两种抗原上不同的基因型。目前，使用活减毒或灭活疫苗预防性地控制疾病，但这些疫苗仅对同源菌株提供保护，对异源菌株的效力为零或部分。2019年，显示具有PRRSV GP5-Mosaic（糖蛋白5）序列的DNA疫苗候选物是免疫原性的，并对猪的病毒感染提供保护。借助in silico算法，可以组装不同PRRSV菌株的片段，这些片段诱导免疫反应，使用mRNA疫苗平台制作单一疫苗。这样的疫苗可以为两种类型的菌株提供广泛和有效的免疫，无论是同源还是异源菌株。 冠状病毒引起许多新兴大流行疾病，如严重急性呼吸综合征、中东呼吸综合征和新型冠状病毒病，感染了牛、水牛、猫、狗和猪等各种动物。抗体通过与冠状病毒的刺突(S)糖蛋白结合来中和病毒，该蛋白由S1和S2亚基组成。受体结合域(RBD)位于S1亚基中，参与特异性受体结合，而S2亚基参与宿主和病毒细胞膜的融合。随着对动物冠状病毒(猪急性腹泻综合征冠状病毒、牛冠状病毒、传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒)的细胞表面受体和新型受体结合域的研究进展，基于RBD的mRNA疫苗似乎是限制动物冠状病毒疾病出现和再现的有效策略。 在兽医领域经济上重要的 Pestiviruses，如牛病毒性腹泻病毒、经典猪瘟病毒和边缘病病毒。Pestiviruses 编码的三种糖蛋白包括 E1、E2 和 Erns(E 核糖核酸酶)。E2 是中和抗体的主要靶标。用作疫苗的 E2 亚基激活了体液免疫反应和细胞介导的免疫反应，因此基于 E2 的 mRNA 疫苗可以提供有效的保护。需要进一步评估 mRNA 疫苗，以评估在自然动物宿主中疫苗管理后发生的过敏反应。用于动物的疫苗必须是经济实惠且易于获得的，以便兽医可以访问它们。在未来，mRNA 疫苗在动物中的使用似乎是一种非常有效的方法，用于控制各种病原体疾病，由于上述讨论的许多优点。 7.结论 目前，科学家们对基于RNA的方法在疫苗开发中的兴趣日益增加，这些疫苗可用于预防和控制疾病。mRNA疫苗在用于临床前和临床试验的动物模型中激发了安全且持久的免疫反应。它在兽医领域对动物传染病有很强的潜力，并且比其他形式的疫苗具有某些优势，如感染风险消失、无逆转为毒力的风险，并且可以在一种疫苗中组装多种抗原，同时对多种病原体进行免疫，易于准备且处理和储存非常方便。mRNA疫苗为预防传染病提供了显著的保护性免疫来源，这一点已经通过COVID-19疫苗的成功应用得到证实。这一成功为预防一系列传统疫苗方法具有挑战性的传染病开辟了新的可能性。由于疫苗的快速发展，它可能是应对新兴传染病的一个有希望的平台。然而，要充分利用mRNA疫苗在未来的潜力，必须解决某些挑战，如配方、疫苗犹豫和广泛获取。 识别微信二维码，添加生物制品圈小编，符合条件者即可加入 生物制品微信群！ 请注明：姓名+研究方向！ 版 权 声 明 本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

研究团队在2型糖尿病小鼠模型HFD小鼠上对NOX-6-18针对糖尿病及葡萄糖代谢的治疗效果进行评估，发现NOX-6-18 给药4-6周，高脂小鼠葡萄糖耐量得到改善 哺乳动物细胞中的脂质代谢是复杂的，目前知道有四种主要形式：首先，脂质可通过磷脂的生物合成和膜的生物发生过程形成细胞和胞内细胞器膜。第二，作为体内主要能量分子ATP生产的备用能源。第三，代谢为多种脂质分子，作为信号分子以选择性和特异性的方式激活受体来调节细胞功能。第四，脂质以形成甘油三酯的形式储存在脂肪组织中。已有的研究表明，脂质信号调节通路对维持糖代谢稳态发挥着重要的作用，比如，美国加州大学Jerrold M Olefsk教授团队发现鱼油中omega-3脂肪酸以及内源性脂质如PAHSA可以通过GPR120发挥抗炎和胰岛素增敏的作用(Cell. 2010 Sep 3;142(5):687-98.)。于晓教授联合孙金鹏教授团队发现胰岛中内源性LCFA-GPR120环路对于胰岛稳态发挥重要作用以及引起不同下游信号通路响应的分子机制（Diabetes. 2022 Jul 1;71(7):1454-1471.；Science. 2023;380(6640):eadd6220.）。在1型和2型糖尿病的进展过程中，糖尿病并发的脂质代谢紊乱也加重了糖尿病的进程，高水平的饱和游离脂肪酸会导致组织和细胞中氧自由基的过量产生，与糖耐量受损的发展有关，且是糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病神经病变等严重并发症的关键因素(Physiol. Rev, 93 (1) (2013), pp. 137-188.; Diabetologia, 48 (4) (2005), pp. 752-755)。此外糖尿病的发展通常伴随脂质过氧化产物的增加，如12-HETE, LTB4等也被发现可能通过选择性激活G蛋白偶联受体介导各种炎症和过敏反应(J. Biol. Chem, 286 (39) (2011), pp. 33832-33840.; J. Exp. Med, 192 (3) (2000), pp. 439-446.), 这些氧化脂肪酸代谢产物可能在糖尿病的外周并发症的病因中起重要作用(Sci. Signal, 8 (361) (2015), p. ra10.)。研究脂质代谢小分子对各种代谢器官和组织的调控作用是近年来内分泌和代谢学科的研究难点和热点。 目前的科学研究表明，胰岛环路障碍是糖尿病发生的核心因素之一。比如，美国加州大学Huising教授研究团队和于晓教授团队发现尿皮质素3 (UCN3)介导的β细胞-δ细胞相互作用在糖尿病发生发展过程中发挥关键作用（Nat Med. 2015 Jul;21(7):769-76，J Clin Invest. 2017;127:2631-2646; Nat Commun. 2022 Nov 5;13(1):6670）。延续这一工作，于晓教授发现，敲除胰岛δ细胞，会导致围产期小鼠胰岛素水平异常升高和小鼠低血糖死亡（Cell Death Dis. 2018;9:682.），以及胰岛内源性脂肪酸激活GPR120调控胰岛 δ 细胞-β 细胞环路引起不同下游信号通路响应的分子机制（Diabetes. 2022 Jul 1;71(7):1454-1471.；Science. 2023;380(6640):eadd6220.）。平行于胰岛 δ 细胞-β 细胞环路，胰岛β 细胞-巨噬细胞环路也逐渐得到大家的重视。比如说，在1型和2型糖尿病（分别为T1DM和T2DM）背景下，胰岛驻留型巨噬细胞发生重编程并与胰岛内的其他细胞产生信号交流，并参与胰岛的稳态调节以及胰岛病理条件下的炎症反应(Cell Metabolism, 29(2): 457-474; Cell Metabolism, 34(2): 240-255; Nature Reviews Endocrinology, 16(2): 81-90)。而从胰岛β 细胞出发，于晓教授团队最近也发现了胰岛β细胞中的孤儿受体OLFR109可以识别胰岛素肽insB：9-23，通过“刹车机制”控制胰岛素分泌的数量和速度。持续长期的insB：9-23刺激，激活胰岛β细胞-巨噬细胞环路，促进巨噬细胞增殖，损害胰岛稳态，阐明了胰岛β细胞嗅觉受体olfr109与胰岛巨噬细胞之间的细胞通讯对胰岛稳态的调控机制（Cell Metabolism. 2022;34(2):240-255；Trends Cell Biol. 2023 Jun;33(6):463-476.）。值得注意的是，南京医科大学韩晓教授研究发现在高脂等压力条件下胰岛β细胞释放外泌体miR29与单核/巨噬细胞作用，加剧胰岛炎症（Cell Rep, 2021. 34(1): p. 108576）。 尽管以上这些研究已广泛揭示胰岛驻留型巨噬细胞介导的炎症以及脂质代谢平衡在糖尿病发展中的关键作用，但是胰岛驻留巨噬细胞是如何启动重编程并诱导胰岛炎症信号的，其机制尚不清楚，胰岛巨噬细胞介导的炎症也缺乏有效干预手段。 为解决这一问题，联合研究团队通过代谢组学的手段观察发现，糖尿病小鼠胰岛内的一种特定氧化脂肪酸9(S)-HODE含量显著增加，并通过选择性激活胰岛驻留巨噬细胞上的GPR132，一种在巨噬细胞特异性高表达的脂类感知受体，它的激活启动了胰岛驻留型巨噬细胞的重编程来促进胰岛细胞的炎症反应。而胰岛巨噬细胞特异性敲除GPR132可显著改善高脂引起的糖代谢紊乱。 接下来，为了确定反转9(S)-HODE-GPR132-Gi信号轴是否可以减少糖尿病进展过程中的胰腺炎症，改善葡萄糖代谢，需要获得GPR132的高选择性激动剂和拮抗剂。联合团队中的焦宁教授是国际上著名的有机化学和药物化学专家。焦宁教授团队前期针对代谢类疾病的药物发现积累了多年的研究经验，创建了基于新合成方法学的药物合成和修饰方法，构建了新结构化合物库 (Nature. 597(7874) (2021):64-69.; Science. 367(6475) (2020):281-285.; Nat. Catal., 3 (2020), 107-115.; Nat Chem., 11(1) ( 2019):71-77.)；已经发现了多个靶向代谢性疾病的候选药物分子。研究团队于是从解析其对内源性配体识别机制和GPR132受体激活的机制入手，开展靶向GPR132的高选择性激动剂和拮抗剂发现研究。研究团队解析了NPGLY-GPR132-Gi和9(S)-HODE-GPR132-Gi复合物的冷冻电镜结构。对结构进行分析发现，两种内源性配体通过两个不同的口袋与GPR132受体结合，NPGLY占据配体结合口袋左侧使口袋呈“L”形，而9(S)-HODE具有更深的配体结合位置，这表明GPR132上有两个“正构位点”，既说明了其配体口袋的可塑性也为基于结构设计小分子激动剂和拮抗剂带来了挑战。 联合研究团队于是进行了分子动力学模拟，分别计算了两个“正构位点”残基的能量贡献，并结合突变验证，确定了配体设计的热点残基。通过虚拟筛选研究团队NOX多样性小分子化合物库，发现苗头化合物NOX-6-1（EC50约为1124nM），结合理性药物设计、合成药物化学和药理学表征，最终成功地发现GPR132选择性激动剂NOX-6-7（EC50约为30nM）。此外，研究团队通过将弱激动剂NOX-6-1中酰胺连接改为磺酰胺连接，发现其不仅消除了Gi的活性，并拮抗了内源性配体激活Gi活性。研究团队采用分子动力学模拟、FlAsH-BRET和生化实验相结合的方法来评估化合物的结合位置，发现了GPR132拮抗剂与激动剂之间转变的关键作用残基，最终找到了GPR132的强效选择性拮抗剂NOX-6-18（IC50约为14nM）。 最后，研究团队在2型糖尿病小鼠模型HFD小鼠上对NOX-6-18针对糖尿病及葡萄糖代谢的治疗效果进行评估，发现NOX-6-18 给药4-6周，高脂小鼠葡萄糖耐量得到改善，这很大程度归因于NOX-6-18在早期阶段对胰岛功能的改善。NOX-6-18给药12-14周以后能够显著改善高脂小鼠的体重，葡萄糖耐量以及胰岛素耐量，并且空腹血糖及胰岛素含量也得到改善。同时NOX-6-18显著降低了胰岛、肝脏和脂肪组织的炎症水平，进而改善了代谢紊乱。综上所述，该研究结果表明内源性氧化脂肪酸9(S)-HODE-GPR132信号通路在胰岛驻留型巨噬细胞重编程以及胰岛炎症中发挥重要作用，靶向GPR132开发的高选择性及高亲和力拮抗剂NOX-6-18能够显著降低胰岛的炎症反应，改善葡萄糖代谢，为糖尿病的治疗提供了新的治疗思路。 北京大学博士生王佳乐、博士后豆晓东，山东大学特别资助类博士后程杰、博士生高明新，北京大学博士生徐国峰、丁金辉及中科院物理所副主任工程师丁玮为本文的共同第一作者；于晓教授，焦宁教授和孙金鹏教授为本论文的共同通讯作者。 于晓教授课题组长期从事内分泌生理和糖尿病的研究，聚焦于胰岛内分泌组织的细胞间环路和GPCR跨膜信号转导对胰岛稳态的维持，以通讯作者在 Nature（2篇），Science（封面文章），Cell（封面文章），Cell Metab，Nature Metab，Nat Chem Biol （2篇），J Clin Invest，PNAS，Diabetes，Nat Commun（2篇）等杂志发表论文40余篇, 在胰岛细胞环路对胰岛稳态调控和GPCR在胰岛中的功能研究方面居于国际前沿水平；焦宁教授课题组长期致力于合成方法学、分子骨架编辑、药物高效合成及筛选、基于代谢类疾病的新药发现等研究，以通讯作者在Nature，Science，Nat. Chem.，Nat. Catal.，Nat. Metab.，CCS. Chem.等期刊发表论文190余篇，在绿色氧化反应，氮化反应，卤化反应等研究中取得了一系列创新性成果，并发现多个针对代谢综合征以及用作光动力治疗的候选药物分子。孙金鹏教授课题组长期聚焦于微环境药理学，系统性的研究了膜受体感知微环境并调控生理功能的机制，以通讯作者在 Nature (x6)，Science (封面)，Cell (x2，封面1篇)，Cell Metab，Nature Metab，Nat Chem Biol (x3)，Cell Research (x2)，PNAS (x5)，Nat Commu (x7)等知名杂志发表90余篇论文，在膜受体对微环境感知和配体识别方面处于国际研究前沿。该项研究得到国家重点研发计划基金、国家杰出青年科学基金、自然基金委重点基金、重大项目、山东省重点研发计划、昌平实验室和新基石科学基金的支持。

糖尿病是全球对人类健康有害的且最难根治的代谢疾病之一。最近的研究发现，糖尿病发展过程中慢性炎症反应是导致其不可逆转的关键因素，但这一过程的机制并不清楚，因而尚无有效的干预策略。2023年9月28日，山东大学于晓教授团队，北京大学焦宁教授团队联合孙金鹏教授团队在Nature Metabolism 在线发表了题为 “Functional screening and rational design of compounds targeting GPR132 to treat diabetes” 的研究论文，这项研究发现氧化脂肪酸脂代谢产物激活GPR132对胰岛驻留型巨噬细胞重编程发挥重要的调控作用，是促发胰岛炎症的重要原因之一。进一步，联合研究团队通过阐明GPR132识别内源性配体9(S)-HODE，NPGLY并激活的分子机制，结合计算机辅助药物设计、合成药物化学以及药理学检测评估手段开发了靶向GPR132的高亲和力及选择性拮抗剂候选小分子NOX-6-18，能够显著改善糖尿病小鼠的胰岛炎症，并提高糖代谢稳态，为治疗糖尿病提供了新的思路。哺乳动物细胞中的脂质代谢是复杂的，目前知道有四种主要形式：首先，脂质可通过磷脂的生物合成和膜的生物发生过程形成细胞和胞内细胞器膜。第二，作为体内主要能量分子ATP生产的备用能源。第三，代谢为多种脂质分子，作为信号分子以选择性和特异性的方式激活受体来调节细胞功能。第四，脂质以形成甘油三酯的形式储存在脂肪组织中。已有的研究表明，脂质信号调节通路对维持糖代谢稳态发挥着重要的作用，比如，美国加州大学Jerrold M Olefsk教授团队发现鱼油中omega-3脂肪酸以及内源性脂质如PAHSA可以通过GPR120发挥抗炎和胰岛素增敏的作用(Cell. 2010 Sep 3;142(5):687-98.)。于晓教授联合孙金鹏教授团队发现胰岛中内源性LCFA-GPR120环路对于胰岛稳态发挥重要作用以及引起不同下游信号通路响应的分子机制（Diabetes. 2022 Jul 1;71(7):1454-1471.；Science. 2023;380(6640):eadd6220.）。在1型和2型糖尿病的进展过程中，糖尿病并发的脂质代谢紊乱也加重了糖尿病的进程，高水平的饱和游离脂肪酸会导致组织和细胞中氧自由基的过量产生，与糖耐量受损的发展有关，且是糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病神经病变等严重并发症的关键因素(Physiol. Rev, 93 (1) (2013), pp. 137-188.; Diabetologia, 48 (4) (2005), pp. 752-755)。此外糖尿病的发展通常伴随脂质过氧化产物的增加，如12-HETE, LTB4等也被发现可能通过选择性激活G蛋白偶联受体介导各种炎症和过敏反应(J. Biol. Chem, 286 (39) (2011), pp. 33832-33840.; J. Exp. Med, 192 (3) (2000), pp. 439-446.), 这些氧化脂肪酸代谢产物可能在糖尿病的外周并发症的病因中起重要作用(Sci. Signal, 8 (361) (2015), p. ra10.)。研究脂质代谢小分子对各种代谢器官和组织的调控作用是近年来内分泌和代谢学科的研究难点和热点。目前的科学研究表明，胰岛环路障碍是糖尿病发生的核心因素之一。比如，美国加州大学Huising教授研究团队和于晓教授团队发现尿皮质素3 (UCN3)介导的β细胞-δ细胞相互作用在糖尿病发生发展过程中发挥关键作用（Nat Med. 2015 Jul;21(7):769-76，J Clin Invest. 2017;127:2631-2646; Nat Commun. 2022 Nov 5;13(1):6670）。延续这一工作，于晓教授发现，敲除胰岛δ细胞，会导致围产期小鼠胰岛素水平异常升高和小鼠低血糖死亡（Cell Death Dis. 2018;9:682.），以及胰岛内源性脂肪酸激活GPR120调控胰岛 δ 细胞-β 细胞环路引起不同下游信号通路响应的分子机制（Diabetes. 2022 Jul 1;71(7):1454-1471.；Science. 2023;380(6640):eadd6220.）。平行于胰岛 δ 细胞-β 细胞环路，胰岛β 细胞-巨噬细胞环路也逐渐得到大家的重视。比如说，在1型和2型糖尿病（分别为T1DM和T2DM）背景下，胰岛驻留型巨噬细胞发生重编程并与胰岛内的其他细胞产生信号交流，并参与胰岛的稳态调节以及胰岛病理条件下的炎症反应(Cell Metabolism, 29(2): 457-474; Cell Metabolism, 34(2): 240-255; Nature Reviews Endocrinology, 16(2): 81-90)。而从胰岛β 细胞出发，于晓教授团队最近也发现了胰岛β细胞中的孤儿受体OLFR109可以识别胰岛素肽insB：9-23，通过“刹车机制”控制胰岛素分泌的数量和速度。持续长期的insB：9-23刺激，激活胰岛β细胞-巨噬细胞环路，促进巨噬细胞增殖，损害胰岛稳态，阐明了胰岛β细胞嗅觉受体olfr109与胰岛巨噬细胞之间的细胞通讯对胰岛稳态的调控机制（Cell Metabolism. 2022;34(2):240-255；Trends Cell Biol. 2023 Jun;33(6):463-476.）。值得注意的是，南京医科大学韩晓教授研究发现在高脂等压力条件下胰岛β细胞释放外泌体miR29与单核/巨噬细胞作用，加剧胰岛炎症（Cell Rep, 2021. 34(1): p. 108576）。尽管以上这些研究已广泛揭示胰岛驻留型巨噬细胞介导的炎症以及脂质代谢平衡在糖尿病发展中的关键作用，但是胰岛驻留巨噬细胞是如何启动重编程并诱导胰岛炎症信号的，其机制尚不清楚，胰岛巨噬细胞介导的炎症也缺乏有效干预手段。为解决这一问题，联合研究团队通过代谢组学的手段观察发现，糖尿病小鼠胰岛内的一种特定氧化脂肪酸9(S)-HODE含量显著增加，并通过选择性激活胰岛驻留巨噬细胞上的GPR132，一种在巨噬细胞特异性高表达的脂类感知受体，它的激活启动了胰岛驻留型巨噬细胞的重编程来促进胰岛细胞的炎症反应。而胰岛巨噬细胞特异性敲除GPR132可显著改善高脂引起的糖代谢紊乱。接下来，为了确定反转9(S)-HODE-GPR132-Gi信号轴是否可以减少糖尿病进展过程中的胰腺炎症，改善葡萄糖代谢，需要获得GPR132的高选择性激动剂和拮抗剂。联合团队中的焦宁教授是国际上著名的有机化学和药物化学专家。焦宁教授团队前期针对代谢类疾病的药物发现积累了多年的研究经验，创建了基于新合成方法学的药物合成和修饰方法，构建了新结构化合物库 (Nature. 597(7874) (2021):64-69.; Science. 367(6475) (2020):281-285.; Nat. Catal., 3 (2020), 107-115.; Nat Chem., 11(1) ( 2019):71-77.)；已经发现了多个靶向代谢性疾病的候选药物分子。研究团队于是从解析其对内源性配体识别机制和GPR132受体激活的机制入手，开展靶向GPR132的高选择性激动剂和拮抗剂发现研究。研究团队解析了NPGLY-GPR132-Gi和9(S)-HODE-GPR132-Gi复合物的冷冻电镜结构。对结构进行分析发现，两种内源性配体通过两个不同的口袋与GPR132受体结合，NPGLY占据配体结合口袋左侧使口袋呈“L”形，而9(S)-HODE具有更深的配体结合位置，这表明GPR132上有两个“正构位点”，既说明了其配体口袋的可塑性也为基于结构设计小分子激动剂和拮抗剂带来了挑战。联合研究团队于是进行了分子动力学模拟，分别计算了两个“正构位点”残基的能量贡献，并结合突变验证，确定了配体设计的热点残基。通过虚拟筛选研究团队NOX多样性小分子化合物库，发现苗头化合物NOX-6-1（EC50约为1124nM），结合理性药物设计、合成药物化学和药理学表征，最终成功地发现GPR132选择性激动剂NOX-6-7（EC50约为30nM）。此外，研究团队通过将弱激动剂NOX-6-1中酰胺连接改为磺酰胺连接，发现其不仅消除了Gi的活性，并拮抗了内源性配体激活Gi活性。研究团队采用分子动力学模拟、FlAsH-BRET和生化实验相结合的方法来评估化合物的结合位置，发现了GPR132拮抗剂与激动剂之间转变的关键作用残基，最终找到了GPR132的强效选择性拮抗剂NOX-6-18（IC50约为14nM）。最后，研究团队在2型糖尿病小鼠模型HFD小鼠上对NOX-6-18针对糖尿病及葡萄糖代谢的治疗效果进行评估，发现NOX-6-18 给药4-6周，高脂小鼠葡萄糖耐量得到改善，这很大程度归因于NOX-6-18在早期阶段对胰岛功能的改善。NOX-6-18给药12-14周以后能够显著改善高脂小鼠的体重，葡萄糖耐量以及胰岛素耐量，并且空腹血糖及胰岛素含量也得到改善。同时NOX-6-18显著降低了胰岛、肝脏和脂肪组织的炎症水平，进而改善了代谢紊乱。综上所述，该研究结果表明内源性氧化脂肪酸9(S)-HODE-GPR132信号通路在胰岛驻留型巨噬细胞重编程以及胰岛炎症中发挥重要作用，靶向GPR132开发的高选择性及高亲和力拮抗剂NOX-6-18能够显著降低胰岛的炎症反应，改善葡萄糖代谢，为糖尿病的治疗提供了新的治疗思路。北京大学博士生王佳乐、博士后豆晓东，山东大学特别资助类博士后程杰、博士生高明新，北京大学博士生徐国峰、丁金辉及中科院物理所副主任工程师丁玮为本文的共同第一作者；于晓教授，焦宁教授和孙金鹏教授为本论文的共同通讯作者。于晓教授课题组长期从事内分泌生理和糖尿病的研究，聚焦于胰岛内分泌组织的细胞间环路和GPCR跨膜信号转导对胰岛稳态的维持，以通讯作者在 Nature（2篇），Science（封面文章），Cell（封面文章），Cell Metab，Nature Metab，Nat Chem Biol （2篇），J Clin Invest，PNAS，Diabetes，Nat Commun（2篇）等杂志发表论文40余篇, 在胰岛细胞环路对胰岛稳态调控和GPCR在胰岛中的功能研究方面居于国际前沿水平；焦宁教授课题组长期致力于合成方法学、分子骨架编辑、药物高效合成及筛选、基于代谢类疾病的新药发现等研究，以通讯作者在Nature，Science，Nat. Chem.，Nat. Catal.，Nat. Metab.，CCS. Chem.等期刊发表论文190余篇，在绿色氧化反应，氮化反应，卤化反应等研究中取得了一系列创新性成果，并发现多个针对代谢综合征以及用作光动力治疗的候选药物分子。孙金鹏教授课题组长期聚焦于微环境药理学，系统性的研究了膜受体感知微环境并调控生理功能的机制，以通讯作者在 Nature (x6)，Science (封面)，Cell (x2，封面1篇)，Cell Metab，Nature Metab，Nat Chem Biol (x3)，Cell Research (x2)，PNAS (x5)，Nat Commu (x7)等知名杂志发表90余篇论文，在膜受体对微环境感知和配体识别方面处于国际研究前沿。该项研究得到国家重点研发计划基金、国家杰出青年科学基金、自然基金委重点基金、重大项目、山东省重点研发计划、昌平实验室和新基石科学基金的支持。专家点评：赵家军：山东省立医院院长，山东省立医院内分泌代谢科学科带头人，“泰山学者”攀登计划特聘专家，山东省科技最高奖获得者，中华医学会内分泌分会主任委员，第十四届全国政协常委。糖尿病的危害有很多，酮症酸中毒、低血糖以及高渗昏迷等急性并发症，在急性发作时甚至可能危及生命。而由糖尿病引起的血管病变，即大血管和微血管损伤，进而导致的慢性并发症，如心血管病、脑血管病、糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、肿瘤等，会直接影响糖尿病患者的寿命与生活质量，给社会和家庭带来沉重的负担(BMJ. 2020 Apr 28;369:m997.;JAMA Cardiol. 2019 Sep 1;4(9):874-883.)。从发现胰岛素开始，学术界对糖尿病的认识逐渐深入，相关治疗药物研发急速发展，靶向糖尿病进程中各个靶点的药物也都相继问世，使得人们对于血糖控制有了越来越大的把握。但是，仅仅控制了血糖的变化并不能高枕无忧。比如，使用胰岛素促泌剂类降糖药后，虽然血糖达标了，但体重上升了。中国70%以上的2型糖尿病患者同时伴有高脂血症。高血脂会引起动脉粥样硬化，是糖尿病引发血管病变的一个关键因素，继发的脂代谢异常同样也会对胰岛，肝脏，脂肪的稳态产生重要影响。因此糖尿病需要综合管理，防控中最重要的因素之一是脂代谢异常。脂质不仅是人体三大营养物质之一，作为人体的备用能源维持人体的正常生理活动，通常也作为信号分子广泛参与细胞信号调控，影响机体各项机能，例如此前的研究发现ω-3脂肪酸具有抗炎和预防代谢性疾病/心血管疾病的功效等(JAMA Cardiol. 2019 Sep 1;4(9):874-883.)。脂代谢紊乱引起的各类脂代谢产物异常积累对胰岛环路有哪些影响，目前还需要更加深入的研究。最近的研究发现，肥胖会诱导胰岛内驻留性巨噬细胞的局部扩增，在功能上，胰岛内巨噬细胞以细胞间接触依赖的方式损害β细胞功能。但是在这个过程巨噬细胞与胰岛β细胞之间的细胞环路如何发挥作用仍未可知，因此，研究胰岛巨噬细胞与β细胞环路的调控机制以及糖尿病进程中的变化，靶向设计药物可能是治疗糖尿病及其严重并发症的新策略。针对这些重要的科学问题，内分泌专家于晓教授，药物化学专家焦宁教授和GPCR药理学专家孙金鹏教授团队通力合作，通过代谢组学的手段检测到氧化脂质9(S)-HODE选择性激活胰岛驻留性巨噬细胞上的GPR132并启动Gi信号途径，发挥对胰岛驻留型巨噬细胞的重编程的调控作用，促进胰岛炎症，接着通过解析不同内源性脂质与GPR132-Gi蛋白复合物的高分辨率冷冻电镜结构，揭开了不同脂质结合GPR132受体激活G蛋白的分子机制。进一步结合系统药理学分析、计算生物学和细胞功能实验，找到了GPR132的强效选择性激动剂，并在此基础上衍生出了强效选择性拮抗剂NOX-6-18，最终在2型糖尿病小鼠模型上进行了功能验证。NOX-6-18给药后能够显著改善了高脂小鼠巨噬细胞重编程，在整体表型上体重，葡萄糖耐量，胰岛素耐量，空腹血糖及胰岛素含量都得到了改善。同时NOX-6-18显著降低了胰岛、肝脏和脂肪组织的炎症水平，进而改善了代谢紊乱。这些重要成果不仅是理论上的重大突破，也为为糖尿病的治疗提供了新的治疗思路。孟卓贤：浙江大学基础医学院，国家优青，浙江大学“百人计划”研究员、博士生导师。社会经济的发展伴随着2型糖尿病（type 2 diabetes, T2D）发病率逐年升高，已成为席卷全球的公共卫生危机，严重危害人类健康，造成了巨大的社会负担和经济损失。糖尿病是一种以胰岛素抵抗和β细胞功能障碍引起的高血糖为特征的代谢性疾病，是由遗传和环境因素共同作用引起的。进食后血糖水平升高，胰岛β细胞首先感受血糖水平变化，分泌胰岛素，进而促进外周组织如骨骼肌摄取葡萄糖，使血糖维持在正常范围，这个过程中β细胞的重要性不言而喻。骨骼肌细胞中也存在葡萄糖感受通路，能够直接感受血糖水平的动态变化，与传统的胰岛素信号通路协同作用，在正常餐后血糖的维持和糖尿病高血糖发生发展过程中发挥重要作用（Mol Cell. 2017;66(3):332-344.e4）。在T2D进程中，β细胞经历了由代偿到失代偿的动态变化。在疾病早期，应对包括糖脂毒性、内质网应激、氧化应激、炎症因子在内的代谢应激因子的刺激，β细胞启动代偿反应：代偿性增强单个细胞的胰岛素分泌功能，通过增殖增加细胞数量，以响应日益增加的胰岛素需求；随着疾病的进展，代谢应激因子经年累月的刺激对β细胞产生不可逆的损伤，使β细胞代偿能力丧失，出现细胞去分化、转分化甚至凋亡。利用高脂饮食（HFD）诱导的肥胖和T2D小鼠模型，我们近期研究系统描绘了T2D进程中胰岛β细胞功能和多组学动态变化全景图谱，并在此基础上阐明了饮食干预通过CTCF介导的转录重编程改善T2D胰岛β细胞功能损伤和葡萄糖代谢紊乱（J Exp. Med. 2022; 219 (7): e20211779）。值得一提的是，胰岛β细胞除了与胰岛δ和α细胞进行信号交流外，胰岛巨噬细胞也可以通过分泌可溶性因子，如IL-1β，TNF-α等，或者直接通过细胞-细胞接触的方式损害β细胞功能(Diabetes, 2006. 55(10): p. 2713-22, Diabetologia, 2014. 57(8): p. 1645-54, Cell Metab, 2019. 29(2): p. 457-474.e5)。近年来，胰岛β 细胞-巨噬细胞之间的相互作用逐渐得到大家的重视。例如胰岛巨噬细胞可通过分泌PDGFα促进胰岛β细胞的代偿性增殖等调控胰岛稳态，同时胰岛中驻留巨噬细胞的增殖也受到了β细胞释放的ATP的调节(Diabetologia, 2018. 61(1): p. 182-192, J Exp Med, 2017. 214(8): p. 2369-2385, Nat Rev Endocrinol, 2020. 16(8): p. 448-466)。其中值得一提的是，南京医科大学韩晓教授研究发现在高脂等压力条件下胰岛β细胞释放外泌体miR29与单核/巨噬细胞作用，加剧胰岛炎症(Cell Rep, 2021. 34(1): p. 108576) 。胰岛β细胞-巨噬细胞环路的正常维持，以及他们在糖尿病病理过程中的变化，并开发针对性的药物，有望成为发展出改善糖尿病稳态和胰岛退分化的新型疗法。山东大学于晓教授长期从事糖尿病中胰岛环路以及GPCR的功能研究。最近，于晓教授联合北京大学焦宁教授和孙金鹏教授等在Nature metabolism发表的这篇文章首先运用代谢组学的手段发现氧化脂肪酸9(S)-HODE通过选择性激活胰岛驻留巨噬细胞上的GPR132，启动了胰岛驻留型巨噬细胞的重编程来促进胰岛的炎症反应。接下来结合冷冻电镜结构生物学和计算生物学等研究手段，作者发现了GPR132上有两个“正构位点”，说明了其配体口袋的可塑性。进一步通过分子动力学模拟和药理学表征，作者找到了靶向胰岛驻留型巨噬细胞GPR132的强效选择性拮抗剂：NOX-6-18。接着，作者在HFD 喂养的小鼠模型上评估了NOX-6-18对肥胖和糖尿病的治疗效果，发现NOX-6-18后能够显著减轻HFD诱导的小鼠体重增加、葡萄糖耐量受损以及胰岛素抵抗，伴随空腹血糖及胰岛功能的显著改善。机制方面，研究人员发现NOX-6-18显著降低了胰岛、肝脏和脂肪组织的炎症水平，进而改善全身代谢紊乱。总之，这些重要研究发现阐明了胰岛内巨噬细胞与β细胞互作的新机制，为靶向胰岛驻留型巨噬细胞治疗胰岛β细胞功能损伤和糖尿病提供了新方向和新依据。文章来源“iNature”责编|文竞择校对|文竞择End往期精选围观历史性突破！不需卵子和精子就可以合成人类胚胎热文富豪用儿子血浆“回春”科学吗？Science：血液牛磺酸缺乏驱动衰老热文世界首例！35岁的她，通过机器人操刀移植的子宫，成功诞下宝宝热文为了避免心脏骤停，53岁的他成为“第一个”植入开创性除颤器的心脏病患者热文首次披露！175家生物制药公司的薪资数据：薪资中位数达20万美元点击“阅读原文”，了解更多~