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摘要：单克隆抗体（mAbs）是用于人类治疗、诊断和成像的生物制药中最大的一类。具有类似人类翻译后修饰的全长mAbs几乎只在哺乳动物细胞培养中表达。遗传工程技术和工艺开发的进步使得优化细胞系和制造工艺的开发成为可能。影响生产过程产量的主要因素是积累目标生物量所需的时间、过程持续时间和所使用细胞系的比生产率。本章讨论了细胞系、培养基、培养参数和过程操作模式对产品产量和质量的贡献。 除了哺乳动物细胞培养，酵母和丝状真菌是广泛使用的真核表达系统，用于重组蛋白生产。它们能够进行mAb生产所需的翻译后修饰，尽管必须考虑蛋白质糖基化的差异。本章概述了作为全长mAbs和抗体片段生产宿主的酵母、真菌和更高真核物种，并强调了高效mAb生产所需的关键细胞和过程工程步骤。 1 引言 1.1 抗体和不同的抗体格式 单克隆抗体和抗体片段是应用于研究、诊断和疾病治疗的重要生物技术产品。最常用的抗体类别是免疫球蛋白G（IgG），这是一种大约150 kDa的异源四聚体分子，由两个重链和两个轻链通过二硫键连接而成。每个链都通过进一步的分子内二硫键稳定，并由一个恒定部分（重链中的CH1-CH3结构域和轻链中的CL）和一个决定结合特异性的可变域（VH和VL）组成。IgG的重链在CH2结构域中包含一个N-糖基化位点，糖链的存在和结构对抗体效应功能很重要。最广泛使用的抗原结合抗体片段是Fab片段，由VH-CH1和VL-CL结构域通过二硫键连接而成，以及单链可变片段（scFV），仅由VH和VL结构域通过连接肽连接而成。另一个重要的抗体格式是单可变域（VHH）抗体或“纳米抗体”，它们源自骆驼和鲨鱼自然产生的仅重链抗体的抗原结合域。 1.2 产品质量属性 产品质量对任何生物分子都很重要，因为它直接影响生物活性、药代动力学、免疫原性风险和安全性。对于单克隆抗体，主要的质量属性通常包括与(1)糖基化、(2)电荷分布、(3)分子大小、(4)氧化和(5)结构相关的变体。除了与工艺相关的杂质（例如，外来因子、宿主细胞蛋白、DNA）。以下部分概述了在制造过程中生物反应器中存在的条件对产品质量属性的影响。 1.2.1 糖基化 单克隆抗体重链的主要寡糖结构是一种双天线复杂型结构，大多数核心岩藻糖化部分带有双分支N-乙酰葡萄糖胺，并且一小部分可能在天线上携带一个或两个唾液酸残基。最重要的变化是由半乳糖化程度和不同比例的截短糖型决定的。半乳糖化介导补体依赖性细胞毒性（CDC），因为抗体与C1q的结合增加，但末端半乳糖残基对血清半衰期没有影响。尽管岩藻糖化在超过80%的血清IgG中自然发生，但研究表明非岩藻糖化IgG显著增加抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC），因为FcγRIIIa受体结合增强。与中心甘露糖残基结合的双分支N-乙酰葡萄糖胺是另一个重要的糖分子，它增强了ADCC。唾液酸化通常因其对血清半衰期的有益效果而闻名，但末端唾液酸也可能减少ADCC。最后，非糖基化重链以及高甘露糖型糖链结构也是典型的发现。 1.2.2 电荷分布 通过色谱分离将mAb制剂分为不同的峰分数（主峰、酸性区域和碱性区域），可以观察到与电荷相关的mAb变体，从而了解生物过程或配方/储存条件可能导致的化学和酶促修饰。例如，酸性电荷变体可能来自糖变体和/或去酰胺反应，而天冬氨酸的异构化、N-末端焦谷氨酸、C-末端赖氨酸、C-末端脯氨酸或亮氨酸酰胺化可能导致碱性电荷变体。 1.2.3 分子大小 高分子量物种（HMWS）由于蛋白质聚集（即二聚体）而形成。低分子量物种（LMWS）如蛋白质主链截断片段暴露新的表位，可能对体内的免疫原性或药代动力学特性产生负面影响，以及与mAb单体相比活性低或显著降低。HMWS和LMWS都有助于mAbs的大小异质性，对药物的安全性和有效性至关重要。 1.2.4 氧化 甲硫氨酸的氧化可能干扰mAb与其靶标的结合亲和力，从而降低其有效性，特别是如果氧化发生在互补决定区。 1.2.5 结构 序列变体是由于DNA突变或氨基酸的错误掺入导致的错误的氨基酸替代，可能导致错误折叠或聚集的mAbs。半胱氨酸替代可以形成游离硫醇变体、意外的二硫键和修饰的二硫键连接。 2 在哺乳动物细胞中的抗体生产 2.1 宿主细胞系 CHO、NS0、Sp2/0、HEK293和PER.C6细胞是重组单克隆抗体表达最突出的宿主细胞系。然而，只有由CHO、NS0和Sp2/0细胞生产的单克隆抗体被批准用于人类治疗。所有这些细胞系都相对容易在悬浮生物反应器中生长，显示出可观的生产特性，并分泌具有适当翻译后修饰的单克隆抗体。由于所有永生化细胞系都是非整倍体的，具有不均匀的染色体数量，即使来自同一来源的细胞群体也存在差异。例如，自最初引入以来，CHO细胞经历了广泛的突变和克隆选择。染色体片段的几次缺失、易位或重排导致不同CHO细胞系之间的遗传异质性，即CHO-K1、CHO-S、CHO-DG44和CHO-DXB11。值得注意的是，当在相同条件下表达相同的单克隆抗体时，一些CHO细胞系已经进化为倾向于蛋白质生产或生物量合成。CHO宿主细胞系之间的产品合成速率差异可能源于它们的翻译机器的容量和处理效率不同。例如，与CHO-DUXB11相比，CHO-K1较大的内质网和更高的线粒体质量与更高的生产力相关。然而，即使在CHO-K1和CHO-DG44细胞的祖先的假定单克隆群体中也存在相当大的异质性。此外，细胞转染感兴趣的基因会导致数千个在表达水平和生长速率上不同的克隆。因此，不管应用的细胞系如何，都必须进行大量的筛选活动，以选择具有所需特性的最终生产克隆。关于糖基化，已经确定了不同宿主细胞系之间的一般差异。 人类细胞系，即PER.C6和HEK细胞，显然具有完全人类生产机器的优势，提供正确的翻译后修饰和人类相同的糖基化。HEK细胞仅被考虑用于瞬时mAb表达。HEK细胞具有高度的转化性，这可能会影响表达蛋白的糖基化模式。在特定情况下，与CHO细胞相比，HEK细胞中的mAbs具有较低的唾液酸化。包括CHO和BHK细胞在内的仓鼠源性细胞系不表达人类免疫原性糖链表位alpha-gal和Neu5Gc（与小鼠细胞系不同）。相比之下，CHO细胞不表达α-2,6-唾液酸转移酶（α-2,6-SiaT）和β-1,4-N-乙酰葡萄糖胺转移酶（GnT-III），这些酶在人类糖链结构中添加末端连接的α-2,6-唾液酸和双分支N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）。相反，CHO细胞只产生α-2,3连接的N-糖基部分的末端唾液酸化。 2.2 细胞培养基 初始的细胞培养基包含血清，为细胞提供丰富的矿物质、脂质、激素、代谢物和有益蛋白（例如，生长因子）来源。为了避免批次间变异带来的潜在风险，这可能对工艺稳健性产生负面影响，以及引入外来因子（例如，病毒、朊病毒和支原体），开发了无血清培养基。在这些培养基中，血清通常被酵母、植物（例如，大豆或小麦）或酪蛋白衍生的水溶性蛋白水解物——胨所替代。胨在化学上是未定义的，含有肽、氨基酸、无机盐、脂质、维生素和糖。胨可能通过与增加重组蛋白表达相关的细胞生长促进效应。然而，胨在化学上的未定义性质、批次间变异和在细胞培养中非特异性效应降低了生物工艺的稳健性。如今，大多数生产过程依赖于完全化学定义的细胞培养基。这些培养基是最先进和昂贵的配方，包含完全定义的、无动物成分的高纯度重组蛋白和/或激素来源，以实现低批次间变异和高工艺稳健性的高细胞培养性能。 除了细胞系开发、克隆筛选和分离以及增强的工艺监测和控制等其他进展外，在过去几十年中，培养基开发尤其取得了进步，以实现不断增加的细胞和产品浓度。而30年前，旧的生物工艺在简单批培养中运行1周，细胞浓度达到3×106细胞/mL，滴度为100 mg/L，二十年后，培养基配方和喂养策略的进一步改进使得工艺持续时间更长、细胞密度更高，单克隆抗体滴度为1-5 g/L。如今，滴度甚至超过10 g/L的进料批培养正在成为现实。尽管已有众多商业化的培养基配方，但必须考虑每个克隆对细胞培养基（和环境培养条件）的个体需求，这在表达产品时进一步扩展。因此，培养基开发是每个新生成的细胞系固有的活动。 除了追求更高的滴度外，重点已转向能够控制产品质量和工艺一致性。关于产品质量，糖基化尤其重要，有许多因素可以变化以进行调节。除了生物反应器中的环境工艺条件（例如，溶解氧、pH、温度、pCO2和工艺持续时间）外，某些代谢物、营养物质和微量元素的可用性也影响糖基化。例如，高浓度的氨是不理想的，因为阻止了末端糖基化。葡萄糖和谷氨酰胺是细胞的主要能量供体，作为合成细胞内核苷酸糖的重要底物，对N-糖基化至关重要。甘油已被证明可以增强唾液酸化。半乳糖、尿苷或微量元素锰直接影响半乳糖化。一般来说，微量元素可以调节各种酶和转运蛋白（例如，糖基转移酶、甘露糖苷酶和溶酶体水解酶）的活性，因此影响糖基化。此外，锰、锌和钴等微量元素被证明可以减少低分子量物种（LMWS）的形成，而铜则有相反的效果。 2.3 环境培养参数 生物工艺需要特定的设定点，以促进细胞培养达到高细胞和产品浓度。培养操作参数经常在工艺优化期间被靶向，包括物理和化学参数。最重要的物理参数包括温度、气体流量和搅拌速度。关键化学参数包括溶解氧（DO）、二氧化碳、pH、渗透压、氧化还原电位和代谢物水平，包括底物、氨基酸和废物副产品。调节这些参数时要小心，因为即使是小的变化也可能对产量和表达产品的质量产生不利影响。 动物细胞培养过程的温度通常设定为生理值37°C。在文献中，研究了大约25-39°C的温度范围，但明显集中在30-37°C。降低温度通常被认为会降低细胞特定的生长速率，并通常伴随着其他积极效应，如培养寿命延长、营养消耗减少、活性提高和蛋白酶活性降低。此外，低温条件可能影响细胞周期，并可能导致细胞特定生产力增加，从而提高产品产量。然而，这种效应是细胞系依赖的。由于培养温度的变化也被报道影响产品质量属性，如蛋白质糖基化，因此必须密切监控此参数。 培养pH是另一个重要参数，极大地影响细胞生长和生产力。动物细胞的典型pH设定点为中性到微碱性（7.0-7.2）。在微酸性pH（6.8-7.0）下，细胞表现出降低的细胞代谢并倾向于更慢地生长。在微碱性pH（>7.2）下，动物细胞的代谢趋于更活跃。pH对重组蛋白生产的影响是细胞系特定的。一些报告声称在更碱性的pH值7.6-7.8下有更高的特定生产力。其他团体报告在广泛的pH范围6.8-7.3或6.85-7.8内水平相当恒定。培养pH的设定点必须在一个狭窄的死区内控制，因为小的偏差可能导致产品质量属性的变化，如蛋白质糖基化。pH设定点在6.8到7.8之间可能影响半乳糖化、唾液酸化和微异质性。 DO设定点通常在20%到50%空气饱和度之间，对为细胞提供足够的氧气至关重要。DO的限制可能导致乳酸产生增加（酸化），而高DO值可能导致细胞毒性。在少数情况下，DO值对生产率、细胞代谢和糖基化施加了细胞和/或产品特定的效应。 溶解CO2使培养pH酸化，如果生物反应器中捕获了大量CO2，则需要添加碱。这是不受欢迎的，因为它增加了渗透压。高CO2水平（>120 mm Hg）可能对细胞培养产生抑制作用，并影响产品质量。 细胞培养基的渗透压通常在260到320 mOsm/kg之间。在进料批培养期间，通过添加碱或过度喂养，渗透压值会增加到更高的数字。高渗透压通常与增加的细胞大小和降低的细胞生长相关。特别是降低的细胞生长（或无生长）对某些细胞系的细胞特定生产力和滴度产生积极影响。最后，从生物反应器中收获的时间点可能具有关键影响。尽管广泛的培养通常可以积累高产品浓度，但细胞活性在发酵结束时自然降低，溶解的细胞释放其细胞内内容物。因此，降解酶如糖苷酶以及蛋白酶与产品接触并降低产品质量和数量。 2.4 生物反应器操作模式 对于单克隆抗体制造，生物反应器原则上可以以不同的操作模式运行。历史上，批培养首次用于生产过程，是最简单的操作模式。接种后，最大细胞生长受到营养物质（例如，葡萄糖、谷氨酰胺）的限制或废物产物抑制（例如，氨、乳酸）的影响。由于相对较低的细胞和产品浓度，批培养不推荐用于当今的生物工业要求。 在进料批培养期间，营养物质（半）连续地供应给生物反应器中的细胞。控制营养物质的添加缓解了营养物质耗尽的限制效应，通常增加了培养寿命、细胞浓度、细胞特定生产力和产品产量。进一步生长的限制来自于代谢副产品的积累或由于定期添加浓缩饲料介质而导致的高渗透压。如今，进料批培养是单克隆抗体制造的标准。 动物细胞的连续培养（例如，化学计量培养器）的特征是新鲜培养基不断添加到生物反应器中，而废培养基不断收获。对于这种培养类型，希望在所谓的稳态期间实现恒定条件（例如，细胞特定生长和生产力、营养物质、代谢副产品、产品和细胞的浓度、培养体积、溶解氧浓度、pH）。这为细胞和产品创造了一个相当稳定的环境，特别是对于不稳定的产品特别有益。然而，由于通常达到的细胞浓度相当低，化学计量培养更适用于在稳态环境条件下研究不同培养变量的影响，而不是单克隆抗体生产。 灌注培养是一种连续培养类型，依赖于新鲜培养基的不断添加，而废培养基则不断从生物反应器中移除。与化学计量培养不同，灌注培养使用细胞保留装置，如离心、内外旋转过滤器、重力沉降器、切向流过滤器、载体或中空纤维模块，以最大化生物量。这显著提高了细胞浓度，甚至超过1×108 c/mL，以及空间-时间产量。此外，产品在生物反应器中的停留时间减少，对质量有益，特别是对于脆弱的产品。因此，灌注培养近年来重新获得流行。灌注技术的进一步应用包括所谓的N-1灌注。在这种情况下，灌注协助在生产生物反应器的N-1阶段积累大量生物量，以高细胞密度接种生产生物反应器。结果，减少了生长期，从而提高了生产能力。另一种称为混合工艺的方法，生产生物反应器最初以灌注模式运行以积累生物量。然后，在高细胞浓度下，该过程转换为进料批培养，直到发酵结束。通过这种策略，可以进一步推动生产能力。一种类似的方法称为浓缩进料批过程。然而，在这种过程类型中，超滤膜被用来保留细胞以及产品在生物反应器中。 连续制造的实施带来了几个优势。例如，高产量的灌注培养允许建造更小的生产生物反应器，因此也减少了种子培养过程中所需的生物反应器数量。这减少了初始资本投资。正如Bielser等人所综述的，小型设施提供了更大的生产灵活性，考虑到由于产品成功、需求变化、竞争、临床试验失败、不断增长的临床管道（包括新类别的分子）、市场压力、或促进市场采用的不确定性，快速变化的市场尤其重要。 来自支付方的压力和进入发展中市场的机会要求降低制造成本和新投资的资本。Xu等人[58]使用非常相似的培养基比较了不同过程模式的性能，以提供公平的比较。在灌注（高达2.29 g/L/天）和浓缩进料批过程（高达2.04 g/L/天）中获得了更高的空间-时间产量，与低或高细胞密度接种的进料批过程（从0.39到0.49 g/L/天）相比。Bausch等人也提出了类似的结果，一个单克隆抗体生产的CHO细胞系在灌注培养（1.10 g/L/天）中的空间-时间产量比进料批模式（0.31 g/L/天）高出3.5倍。在这两项研究中，高空间-时间产量主要是由于维持了更高的细胞浓度，因为所有生产模式的细胞特定生产力都是可比的。这表明连续技术可以导致工艺强化。 对于进料批和连续灌注技术之间的经济比较，必须针对每个分子单独进行，以解决资本支出（CapEx）、运营支出（OpEx）或商品成本（CoG）。一般来说，灌注操作的实施可能会带来CapEx节省，因为所有单元操作的占地面积较小。OpEx需要彻底评估，因为主要驱动因素是连续生产中的培养基消耗。优化灌注培养基，以在低灌注率和理想情况下低成本下最大化空间-时间产量，将降低OpEx。在Bunnak等人对进料批和灌注过程的生命周期和CoG评估中，作者计算了两种技术之间的类似CoG。然而，灌注培养的能源需求（17%）、水消耗（35%）和CO2排放（17%）更高。除了对实施进料批或灌注技术的个体比较外，灌注过程的全部潜力最有可能在完全连续的端到端集成制造过程中实现，其中上游单元操作直接连接到连续的下游单元。 3 在酵母和丝状真菌中的抗体生产 3.1 表达系统的一般特性 如今，哺乳动物细胞系是最常用的单克隆抗体生物制药生产表达系统。它们可以执行类人糖基化，在典型的优化过程中，可以在10-16天内达到3-10 g/L的高产量。作为真核生物，酵母和丝状真菌通常具有执行复杂药物蛋白生产所需的所有翻译后修饰的能力。一个主要优势是有效的遗传工程技术的可用性，这允许简单和快速的菌株开发。作为微生物，酵母和丝状真菌表现出快速生长，可以在简单和廉价的底物上达到超过100 g/L干质量的高细胞密度，并且可以在短工艺时间内获得所需蛋白的高滴度。与大肠杆菌等原核系统相比，重组蛋白可以有效地靶向到分泌途径，其中发生蛋白质糖基化等翻译后修饰。此外，从细胞分泌后，正确折叠的功能性产品可以很容易地从通常含有非常少量不希望的宿主细胞蛋白的培养上清中纯化。 3.2 糖基化和糖基工程菌株 蛋白质糖基化对于许多复杂生物制药的生产至关重要，如抗体。作为真核生物，酵母和真菌可以有效执行蛋白质N-和O-糖基化。然而，它们产生的是高甘露糖型糖链，甘露糖数量不一，缺乏复杂哺乳动物糖链中发现的额外N-乙酰葡萄糖胺、半乳糖和唾液酸。由于它们在结构和组成上的差异，真菌糖链被认为是对人类潜在免疫原性的。因此，已经做出了巨大努力来开发产生具有类人糖链的制药相关蛋白的酵母菌株。删除α-1,6-甘露糖基转移酶Och1可以消除酿酒酵母和毕赤酵母中蛋白质的超甘露糖基化。不同的糖基工程方法结合了酵母型糖基化的删除与异源糖基转移酶和糖苷酶的表达，使得在几种酵母物种中生产具有类人N-糖链的蛋白。此外，糖基工程化的毕赤酵母菌株也已成功用于生产具有类人糖链的功能IgG。另一种方法是使用体外糖基化以精确附加所需的糖链结构。关于酵母O-糖基化的工程研究较少。一般来说，通过删除一些（但不是全部）蛋白质O-甘露糖基转移酶（PMT）基因或添加PMT抑制剂，可以部分抑制酵母特异性O-糖基化。这两种策略都已被证明可以改善毕赤酵母和小奥加氏酵母中抗体的生产和产品质量。有关酵母糖基工程的全面综述，请参考Hamilton等人或De Wachter等人。在丝状真菌里氏木霉和米曲霉中的首次糖基工程研究表明，通过哺乳动物糖基转移酶成功添加了N-乙酰葡萄糖胺，展示了合成复杂糖链结构的潜力。尽管糖基工程使得在酵母和真菌中生产具有类人糖链的IgG成为可能，但它们的主要应用领域仍然是生产不同的非糖基化抗体片段。 3.3 酵母中的抗体生产 许多不同的酵母物种已被用于重组抗体或抗体片段的生产，包括酿酒酵母、毕赤酵母、奥加氏多形汉逊酵母、小奥加氏酵母、克鲁维酵母、解脂耶氏酵母和裂殖酵母。首次成功生产分泌型全长IgG和Fab片段是在研究良好的模型酵母酿酒酵母中完成的。对于在酿酒酵母中生产的首批单链Fv（scFv）抗体片段，发现过表达分子伴侣BiP（酵母中的Kar2）或蛋白质二硫键异构酶（PDI）可以将产品滴度提高两到八倍，最高可达20 mg/L。从那时起，已经开发了不同的菌株工程策略，以进一步提高酿酒酵母中抗体的折叠和分泌。此外，据报道酿酒酵母也非常适合生产抗原特异性的驼单域抗体（VHH）。 用于生产抗体和抗体片段的最常用酵母是甲型酵母毕赤酵母（Komagataella sp.）。毕赤酵母的一个巨大优势是它能够以甲醇作为唯一的碳和能源来源生长，这允许使用强甲醇诱导型启动子（例如，PAOX1）进行重组蛋白生产。此外，毕赤酵母能在简单的底物上生长至非常高的细胞密度，并将蛋白质有效地分泌到培养上清中。1995年，首次在毕赤酵母中生产了几种不同的scFv抗体片段，滴度超过0.1 g/L。应用菌株和工艺优化，这种酵母可以实现超过1 g/L的scFv滴度。过表达分泌途径的分子伴侣和折叠酶或未折叠蛋白响应转录因子Hac1已被证明可以增加毕赤酵母中抗体片段的生产。为了优化特定产品的表达，有多种碳源依赖和独立的启动子可作为强甲醇诱导型PAOX1启动子的替代品。此外，优化的分泌信号已被证明对重组蛋白生产有积极影响。一项比较大肠杆菌、CHO细胞和毕赤酵母中Fab生产的研究显示，可以使用酵母系统以略低的商品成本生产类似数量的功能产品。除了毕赤酵母，其他非传统酵母也被证明适合生产抗体片段。克鲁维酵母能够以乳酸作为唯一的碳和能源来源生长，并且是食品工业中酶生产的良好宿主。一些研究报告了在克鲁维酵母中可溶性生产功能性scFv。在解脂耶氏酵母中也获得了类似的scFv水平。甲型酵母小奥加氏酵母已被研究用于全长抗体的生产。使用蛋白酶缺陷菌株、抑制O-糖基化和过表达分子伴侣都对这种酵母生产功能性mAbs产生了积极影响。另一个替代的酵母表达系统是研究良好的裂殖酵母。通过成功分泌scFv-GFP融合蛋白，展示了其抗体片段生产的潜力。最近一项比较不同表达宿主的研究还描述了对克鲁维酵母、奥加氏多形汉逊酵母和腺苷营养酵母进行抗体生产的研究。 不仅菌株工程，而且工艺优化对酵母中的抗体生产也有很大影响。通常，对于酿酒酵母和毕赤酵母，分别使用葡萄糖或甲醇限制的进料批工艺进行生产。使用甘油和甲醇的混合进料发酵、优化甲醇诱导水平和氧限制工艺被描述为对毕赤酵母抗体生产有益。优化甲醇浓度和培养pH允许高水平生产超过4 g/L的scFv。对于在糖基工程化毕赤酵母菌株中全长IgG的生产过程，实验设计方法使IgG产量高达1.6 g/L，并且开发的工艺可以成功放大至1200 L生产规模。此外，还努力开发用于连续工艺生产Fab片段的生产菌株和培养基。 3.4 丝状真菌中的抗体生产 丝状真菌如黑曲霉、米曲霉和里氏木霉是工业酶和其他蛋白生产的已建立宿主。它们具有非常高的分泌能力，并且自然分泌大量的超过25 g/L的溶解酶到培养基中。然而，重组蛋白的产量通常显著较低。将异源蛋白与本地分泌良好的蛋白融合已被证明对蛋白生产有益。一些被充分表征的序列包括里氏木霉的纤维素生物水解酶（CBH1）和黑曲霉或米曲霉的葡萄糖淀粉酶（glaA）基因。将Fab重链与CBH1的截短形式融合在里氏木霉中将Fab产量从1提高到40 mg/L。在米曲霉中首次尝试生产VHH时，通过与Taka淀粉酶A信号序列（sTAA）和来自米根霉脂肪酶（N28）N端区域的28个氨基酸片段融合，可以生产73 mg/L VHH。在另一项研究中，当使用葡萄糖淀粉酶-VHH融合时，培养基中可以获得高达1 g/L VHH。其他适合生产抗体的曲霉物种包括米曲霉和黑曲霉。Joosten等人表明，米曲霉可用于生产功能性VHH和VHH-过氧化物酶融合蛋白。黑曲霉已被用于生产全长IgG和Fab片段。将抗体链与葡萄糖淀粉酶和优化的KexB切割位点融合，允许生产与哺乳动物来源IgG类似属性的抗体。最近，模型真菌玉米黑粉菌也被研究作为重组蛋白生产的替代宿主。几丁质酶Cts1的非传统分泌途径可用于分泌异源蛋白，同时避免真菌N-糖基化。已经证明这种方法适用于生产scFv和不同的纳米抗体，但获得的产量仍然很低。 一般来说，蛋白水解降解可能是丝状真菌中异源蛋白生产的问题。在许多情况下，删除宿主蛋白酶已被证明可以提高蛋白产量。此外，添加BSA也被用作减少在米曲霉中生产的VHH的蛋白水解降解的策略。 4.结论 如今，具有类似人类翻译后修饰的全长单克隆抗体几乎只在哺乳动物细胞培养中生产。尽管经典的杂交瘤细胞仍被开发用于分离单个单克隆抗体，但单克隆抗体通常在基因转移后在标准宿主细胞系中被工程化和表达。分子生物学技术的进步使得细胞和基因转移载体的高效遗传操作成为可能，以优化细胞作为生产工厂。细胞系和细胞培养基开发、克隆筛选和分离以及增强的工艺监测和控制的改进为哺乳动物细胞培养中不断增加的细胞和产品浓度铺平了道路。 尽管市场上还没有丝状真菌来源的治疗性抗体产品，但酵母和丝状真菌作为抗体和特别是非糖基化抗体片段的生产宿主具有巨大潜力。最近一项分析不同酵母和丝状真菌中IgG生产的比较研究得出结论，可用的工程工具将允许开发有竞争力的生产宿主。总体而言，这里介绍的例子表明，菌株和工艺工程的结合使得在酵母和丝状真菌中高水平生产功能性抗体产品成为可能，这使得这些表达系统成为开发抗体生产过程的有吸引力的替代品。 要点信息 单克隆抗体产品的最终应用强烈决定了表达系统、过程模式和下游处理工作的选择。 如果需要复杂的翻译后修饰，则哺乳动物细胞是首选的表达系统。 宿主细胞工程和体外蛋白修饰方法使酵母和丝状真菌成为单克隆抗体产品的有前途的替代表达系统。 较低的真核生物在传统的批处理和进料批处理过程中比动物细胞培养更快地生长并达到更高的细胞密度。最近高细胞密度连续工艺的发展使细胞培养技术赶上了酵母细胞。 下章预告：抗体验证 往期内容： 第二章：抗体：发现及特性的历史 第三章：单克隆抗体和杂交瘤细胞 第四章：抗体展示系统 第五章：转基因动物用于产生人类抗体 第六章：抗体在治疗、诊断和科学中的应用 第七章：双特异性抗体 第八章：抗体偶联药物 第九章：替代性结合框架：用于基础研究和治疗应用的多功能结合剂 第十章：嵌合抗原受体（CAR）重定向的T细胞 第十一章：抗体关键特性的改进 第十二章：工程化治疗性抗体以供开发 为促进抗体行业的交流与创新，2024年10月16-17日第七届金秋十月抗体产业发展大会如约而至。会议旨在为研究人员提供一个互动交流的平台，有助于推动抗体产业的进一步发展。 会议内容 时间：2024年10月16-17日 地点：上海张江（酒店定向通知） 规模：600-800人 主办单位：生物制品圈、抗体圈 演讲支持：Entegris、瑞孚迪、AS ONE CORPORATION 会议费用：免费FREE!（仅收取100元报名定金，含参会学习、茶歇、会议手册，定金概不退还），先到先得，报完即止！ 报名方式：扫描下方二维码或点击文章最底部“阅读原文”→ 填写表格 → 报名成功（报名志愿者，承担一定工作，请慎重考虑，免交定金）！ 组委会获得报名信息后，根据报名信息进行初筛，并进一步与报名者沟通确认，实现精准邀请。最终有机会进入大会微信群（严格审核通过）。 日程安排 更多嘉宾正在邀请中 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