FEN1

SAN DIEGO, April 29, 2025 /PRNewswire/ -- Blacksmith Medicines, Inc. (Blacksmith), a leading biopharma dedicated to discovering and developing therapeutics targeting metalloenzymes, today announced the company will present data on its oncology program targeting flap endonuclease 1 (FEN1), a structure-specific metallonuclease that cleaves 5' DNA flaps during replication and repair, at the American Association for Cancer Research (AACR) Annual Meeting 2025, taking place April 25-30 at the McCormick Place Convention Center, Chicago, IL. Details of the poster presentation are as follows: Abstract Number: 5720 Title: "Novel FEN1 nuclease inhibitor shows synergy with PARP-targeting drugs" Session Category: Experimental and Molecular Therapeutics Session Title: PARP Inhibitors Session Date and Time: Tuesday April 29, 2025 2:00 PM - 5:00 PM Location: Poster Section 24 Poster Board Number: 7 The abstract is now available on the conference website at AACR Annual Meeting 2025. About FEN1 Flap endonuclease 1 (FEN1) is a structure-specific di-magnesium metallonuclease that cleaves 5' DNA flaps during replication and repair. FEN1 is an attractive target for development of anticancer therapeutics because it is overexpressed in many tumor types and has a large number of synthetic lethality partners including genes in Homologous Recombination (HR) pathway. About metalloenzymes and the Blacksmith platform Metalloenzymes utilize a metal ion cofactor in the enzyme active site to perform essential biological functions. This diverse class of targets has historically been difficult to drug due to small molecule chemistry limitations that have plagued the industry. The Blacksmith metalloenzyme platform has solved this problem by leveraging the following: A large proprietary fragment library of metal-binding pharmacophores (MBPs); A comprehensive database containing a full characterization of the metalloenzyme genome including functions, metal cofactors, and associations to disease; A first-of-its-kind metallo-CRISPR library of custom single guide RNAs; An industry-leading metalloenzyme computational toolkit for docking, modeling and structure-based drug design; and A robust and blocking intellectual property estate covering bioinorganic, medicinal, and computational chemistry approaches for metalloenzyme-targeted medicines. About Blacksmith Medicines At Blacksmith Medicines, we are developing medicines targeting metal-dependent enzymes. Over 30% of known enzymes are metalloenzymes, covering all major enzyme classes: oxidoreductases, transferases, hydrolases, lyases, isomerases, and ligases. Metal ions, including magnesium, zinc, iron, manganese and copper, are the essential ingredient in these metalloenzymes. We recognized a large unmet need for new chemical matter and innovative approaches to drug this important class of enzymes. Our purpose-built platform for metalloenzyme-targeted medicines combines, for the first time in industry, a focused library of metal-binding pharmacophores with proprietary computational modeling approaches to rapidly and rationally design small molecule inhibitors that interact with key metal ions in the enzyme's active site. Our comprehensive knowledge of the metal environment and key active site interactions enables Blacksmith to rapidly build potent and selective inhibitors in a stepwise and predictable manner. Blacksmith has executed strategic drug discovery collaborations with Basilea Pharmaceutica International Ltd., Cyteir Therapeutics Inc., Eli Lilly and Company (Lilly), Hoffmann-La Roche Ltd., and Zoetis LLC., and has been awarded non-dilutive Federal funding agreements with CARB-X and NIH/NIAID. Blacksmith investors include Lilly, Evotec A.G., MP Healthcare Partners, MagnaSci Ventures, and Alexandria Venture Investments. For further information, please visit the company's website and LinkedIn Media Contact: Amy Conrad Juniper Point [email protected] 858-366-3243 SOURCE Blacksmith Medicines WANT YOUR COMPANY'S NEWS FEATURED ON PRNEWSWIRE.COM? 440k+ Newsrooms & Influencers 9k+ Digital Media Outlets 270k+ Journalists Opted In GET STARTED

“ 点击蓝字 关注我们 北京大学高宁课题组揭示真核DNA复制中冈崎片段引物去除过程的新分子机制 PPS  2024年11月22日，北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心、核糖核酸北京研究中心高宁课题组在The EMBO Journal发表了题为Structural insight into Okazaki fragment maturation mediated by PCNA-bound FEN1 and RNaseH2的研究论文，对含有PCNA的内源相关复合物进行结构研究，获得了两组PCNA复合物（PCNA-FEN1、PCNA-FEN1-RNaseH2）的结构，为理解冈崎片段成熟的后期步骤提供了一系列的结构快照。 真核生物DNA复制在复杂的染色质环境下进行，与多种分子生物学过程互相协调，例如DNA复制与修复的偶联以及DNA复制与新生核小体组装的偶联等。PCNA（Proliferating cell nuclear antigen）作为DNA复制体不可缺少的辅助蛋白，在DNA复制中结合各种DNA聚合酶以赋予其持续合成的能力，也可以将多种因子募集到DNA复制、修复等DNA代谢事件发生的位点，并促进相应的生物学反应，是DNA代谢的中心枢纽之一。与PCNA相互作用的蛋白超过两百多种，包括DNA复制相关蛋白（Pol δ、Pol ε、Pol η、Pol κ、FEN1、LIG1等）、解旋酶（WRN、BLM、RECQ5等）、DNA修复蛋白（MSH3、MSH6、XPG、FANCM等）、表观遗传因子（CAF-1、DNMT1、p300、HDAC1等）及参与细胞周期调控、凋亡等过程的一些蛋白分子，它们都是通过自身保守的PIP box（PCNA-interacting protein box）或PIP-like 基序结合PCNA。 真核生物PCNA是环绕双链DNA的同源三聚体，每个单体都包含一个PIP box结合位点，因此一个PCNA环可以至多结合三个含有PIP box的蛋白因子。领域内认为PCNA的协调功能是通过“工具带，toolbelt”的形式实现，即PCNA同时结合处于上下游过程的不同的酶，以提高DNA代谢相关事件的整体效率。一个具有代表性的例子是DNA复制过程中的滞后链冈崎片段的加工成熟，参与这一过程的所有具有催化活性的酶都与PCNA有相互作用，包括Pol δ、RNaseH2、FEN1、EXO1、PIF1、DNA2以及LIG1。参与引物去除的主要因子是Pol δ、RNaseH2和FEN1，RNaseH2作为RNA核酸酶去除由Pol α与引物酶复合物所合成的RNA-DNA引物中的RNA；DNA聚合酶Pol δ在完成滞后链上的新生DNA链的延伸之后，会进行链置换反应，继续向前合成将临近冈崎片段中的引物顶起，形成5'-flap DNA结构；FEN1作为结构特异性的DNA核酸内切酶结合并切割5'-flap DNA；通过这一系列步骤，保真度较差的DNA引物及RNA引物得以去除。领域前期通过体外重组的方式，已经获得了PCNA-FEN1-Pol δ、PCNA-FEN1-LIG1复合物，对它们的结构和功能进行了表征，部分地验证了PCNA作为工具带的分子角色。然而很多重要的机制性的问题还未得到解答，例如PCNA如何特异性地选择并协调参与同一DNA代谢事件的不同蛋白因子；同时结合在PCNA上的蛋白因子之间是否进行相互的变构调节等。 课题组以PCNA作为诱饵蛋白，首先建立了一套从染色质中快速纯化PCNA内源复合物的方法，得到了一系列含有PCNA且参与DNA复制、核小体组装、DNA修复等过程的内源复合物。 结合冷冻电镜单颗粒三维重构技术解析了两套复合物PCNA-FEN1与PCNA-FEN1-RNaseH2不同状态的三维结构。其中PCNA-FEN1复合物中FEN1处于催化后状态，5'-flap DNA被切割但尚未离开FEN1的酶活中心，表明FEN1的5'-flap DNA产物释放在细胞内是限速步骤。 在PCNA-FEN1-RNaseH2复合物中，发现FEN1与RNaseH2分别结合PCNA的不同亚基，证实了PCNA工具带的功能。对不同状态的PCNA-FEN1-RNaseH2复合物进行结构分析，发现RNaseH2始终结合在FEN1催化位点上游固定的双链DNA区域，并且此区域不包含任何未去除的RNA残基，这表明同时结合PCNA的FEN1与RNaseH2存在一种未被认识到的功能上的耦合。因为5'-flap DNA是聚合酶Pol δ继续向前合成进行链置换的产物，其核苷酸序列与其上游双链DNA序列一致，所以在细胞中5'-flap DNA很可能侵入上游的双链DNA，产生3'-flap DNA，一旦3'-flap长度大于1 nt，FEN1将无法切割5'-flap DNA。然而，当RNaseH2结合在5'-flap DNA上游双链DNA时，由于空间位阻的存在，5'-flap DNA无法进行链入侵，大幅降低了5'-flap DNA转化形成3'-flap DNA的概率，因此RNaseH2可能通过维持DNA底物的特定构象以促进FEN1 5'-flap DNA的酶切效率。 此外，结构分析表明在PCNA-FEN1-RNaseH2复合物中RNaseH2蛋白通过RNaseH2A亚基结合PCNA，而不是之前报道的RNaseH2B PIP box结合PCNA，序列分析鉴定到RNaseH2A亚基中一个新的PIP box，通过体外生化实验验证了RNaseH2A及RNaseH2B亚基的PIP box都可以结合PCNA。结合免疫荧光电镜的成像实验，表明RNaseH2A PIP box与RNaseH2B PIP box在不同的生理学过程中发挥功能。 该研究表明PCNA在细胞内可以作为工具带同时结合多个蛋白因子。之前的模型认为同时结合PCNA的蛋白是按照顺序发挥功能，一个酶发挥完功能后与DNA解离，释放出DNA底物以供另一个酶结合；与之前的模型不同，在PCNA-FEN1-RNaseH2复合物结构中，FEN1与RNaseH2稳定结合同一个DNA底物，RNaseH2可能通过对底物DNA的构象调控来促进FEN1的酶切效率。这表明细胞内同时结合PCNA的不同蛋白因子间可能会对它们酶促反应动力学进行互相调控。RNaseH2除了作为RNA核酸酶参与冈崎片段引物RNA的去除外，该研究发现了RNaseH2的另一个可能的新功能，即以不依赖于核酸酶活性的形式作为双链DNA结合蛋白来调节FEN1的5'-flap DNA酶切功能。 高宁教授为该论文的通讯作者。生命科学学院2020级博士研究生田宇辉为该论文第一作者。生命科学学院研究员李宁宁在实验方法探究及结构计算方面提供了帮助。生命科学学院李晴教授为该论文提供了支持与帮助。该研究得到了国家自然科学基金和昌平实验室的支持。北京大学冷冻电镜平台、昌平实验室冷冻电镜平台、北京大学高性能计算平台、生命科学学院仪器中心及国家蛋白质基础设施（北大分平台）对该项目提供了重要的技术支持。 参考文献: 1. Bellush, J. M. & Whitehouse, I. DNA replication through a chromatin environment.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci372(2017). 2. Li, N.et al.Parental histone transfer caught at the replication fork.Nature627, 890-897 (2024). 3. Slade, D. Maneuvers on PCNA Rings during DNA Replication and Repair.Genes9, 416 (2018). 4. Boehm, E. M., Gildenberg, M. S. & Washington, M. T. The Many Roles of PCNA in Eukaryotic DNA Replication.Enzymes39, 231-254 (2016). 5. Sun, H.et al.Okazaki fragment maturation: DNA flap dynamics for cell proliferation and survival.Trends in Cell Biology(2022). 6. Levikova, M. & Cejka, P. The Saccharomyces cerevisiae Dna2 can function as a sole nuclease in the processing of Okazaki fragments in DNA replication.Nucleic Acids Res43, 7888-7897 (2015). 7. Blair, K.et al.Mechanism of human Lig1 regulation by PCNA in Okazaki fragment sealing.Nat Commun13, 7833 (2022). 8. Lancey, C.et al.Structure of the processive human Pol δ holoenzyme.Nature Communications11(2020). 文章来源：北京大学生命科学学院 美编排版：朱玲欣 文章审核：周碧远 朱玲欣 罗琪 【免责声明】以上内容来源于互联网，不代表本平台立场或观点；如有侵犯作者著作权，请及时与我们联系（Tel：025-83271227，或直接在微信平台留言），我们将及时更正或删除。 《药学进展》杂志由国家教育部主管、中国药科大学和中国药学会共同主办，中国科技核心期刊（中国科技论文统计源期刊）。刊物以反映药学科研领域的新方法、新成果、新进展、新趋势为宗旨，以综述、评述、行业发展报告为特色，以药学学科进展、技术进展、新药研发各环节技术信息为重点，是一本专注于医药科技前沿与产业动态的专业媒体。 《药学进展》注重内容策划、加强组稿约稿、深度挖掘、分析药学信息资源、在药学学科进展、科研思路方法、靶点机制探讨、新药研发报告、临床用药分析、国际医药前沿等方面初具特色；特别是医药信息内容以科学前沿与国家战略需求相合，更加突出前瞻性、权威性、时效性、新颖性、系统性、实战性。根据最新统计数据，刊物篇均下载率连续三年蝉联我国医药期刊榜首，复合影响因子1.216，具有较高的影响力。 《药学进展》编委会由国家重大专项化学药总师陈凯先院士担任主编，编委由新药研发技术链政府监管部门、高校科研院所、制药企业、临床医院、CRO、金融资本及知识产权相关机构近两百位极具影响力的专家组成。 联系《药学进展》↓↓↓ 编辑部官网：pps.cpu.edu.cn； 邮箱：yxjz@163.com； 电话：025-83271227。 欢迎投稿、订阅！ 往期推荐 聚焦“兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”“兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”盛大启幕！院士专家齐聚杭城，绘就生物医药前沿赛道新蓝图“兴药强刊”青年学者论坛暨《药学进展》第二届青年编委会议成功召开“兴药为民·2023生物医药创新融合发展大会”路演专场圆满收官！校企合作新旅程已启航 我知道你在看哟

引言 真核生物的基因组DNA包裹在染色质中，因此真核DNA复制发生在染色质环境下。染色质的基本结构单位是核小体，由147 bp DNA缠绕的组蛋白八聚体组成，组蛋白多种翻译后修饰是表观遗传信息的承载基础。DNA复制时染色质打开然后重新建立，使得DNA复制和染色质复制的偶联，在此过程中亲本染色质携带的表观遗传信息被分配到新合成的子链DNA，因此染色质重建也是表观遗传信息继承的基础，维持基因组和表观基因组稳定。染色质重建的起始步骤是DNA复制偶联的核小体组装，同时也是表观遗传信息继承的关键一环，其核心是DNA合成和核小体组装的偶联。 碱基配对形成了双螺旋结构的DNA，两条链的互补性决定了DNA是以半保留的方式进行复制。组成DNA的两条链是反向平行的，因此解螺旋的DNA的两条单链具有方向，一条是5’-3’，另一条链是3’-5’，但是DNA聚合酶都是5’-3’方向进行合成的，导致复制叉上两条链的合成方向相反。由此DNA复制的一条链是向复制叉前进的方向连续合成，称之为前导链，而另一条链的合成方向和复制叉前进的方向相反，先合成小片段DNA然后连接成完整的DNA分子，这个机制是冈崎夫妇发现的，所以这些短片段称之为冈崎片段，这条链称之为滞后链。滞后链冈崎片段合成先是Pol α合成带有一段RNA的DNA引物，然后发生聚合酶Pol α到 Pol δ的转换，Pol δ继续合成冈崎片段。其间Pol δ通过链置换反应入侵前一个冈崎片段，将含有RNA的保真度较低引物置换，形成单链翘起，进而招募Fen1等核酸酶进行切除被置换的单链DNA，产生的缺口被DNA连接酶（酵母中是Cdc9）连接，保障冈崎片段成熟，形成完整连续的滞后链DNA。伴随冈崎片段合成，核小体也会迅速组装，以免DNA暴露。前期Whitehouse和Smith的研究表明，真核生物的冈崎片段大小与核小体DNA和连接DNA的长度相当，且连接位置在核小体近中轴区，提出滞后链上核小体可以阻碍Pol δ的行进决定冈崎片段的长度【1, 2】。由于没有直接证据，核小体组装和冈崎片段成熟过程的协同机制尚不明确，李晴课题组发展了电镜核酸技术，对此机制进行了解析。 2024年8月9日，北京大学生命科学学院、北大-清华生命科学联合中心李晴课题组在Science Advances发表题为DNA polymerase δ subunit Pol32 binds histone H3-H4 and couples nucleosome assembly with Okazaki fragment processing的研究论文，巧妙利用DNA连接酶降解体系，应用电镜核酸技术观察酵母细胞中DNA复制叉中间体结构，发现核小体中组蛋白和DNA的相互作用决定了链置换的位置，而且DNA聚合酶δ的Pol32亚基在C端有一个组蛋白H3-H4的结合区域，可以直接贡献于后随链上的核小体组装，揭示了后随链上DNA合成和核小体组装的协同机制。 研究者在芽殖酵母中利用AID（Auxin-induced degradation）系统诱导Cdc9在DNA复制早期快速降解，抑制冈崎片段末端的连接，进而在透射电镜下观察DNA复制中间体，发现在超过94%的复制叉上都含有翘起的DNA结构（flap structure），并且这个翘起结构主要集中在其中一条子链上，进一步的分析表明有翘起发生在滞后链 (图1)。通过测量翘起结构 (Flap) 的两个主要特征 (图2)：Flap本身的长度和相邻Flap的间距，研究者发现，1)在野生型背景下，Flap的长度集中分布在52 nt左右，其长度受到Pol δ的链置换活性和Fen1的核酸酶活性调控，而且Flap的长度分布具有13-15 nt的步长，可能是由核小体中周期性组蛋白和DNA相互作用障碍链置换合成造成的。2）相邻Flap的间距与冈崎片段长度相似，集中在190 bp左右。该间距的增大来自于DNA复制偶联的核小体组装突变，例如经典组蛋白分子伴侣CAF-1大亚基Cac1的缺失突变（cac1D）以及Mcm2结合组蛋白突变mcm2-3A，两个突变分别会导致新合成组蛋白的组装缺陷和旧组蛋白回收缺陷，这个间距增加到280bp左右，表明冈崎片段的合成受核小体组装程度调节。 图1：电镜核酸技术观察DNA连接酶降解后的复制叉结构。图示复制泡结构；左图是Cdc9降解后，右图是未降解对照。（Credit: Science Advances） 研究者在Pol δ亚基非催化亚基Pol32缺失突变中观察到flap间距变大，和上述提到核小体组装突变cac1D以及mcm2-3A的间距变化类似 (图2)。研究者进一步通过体内、体外分析直接证明了Pol32的C端可以直接结合组蛋白H3-H4，并通过ReIN-Map方法证明Pol32调节滞后链上的核小体组装。最近有两篇报道也分别揭示Pol32参与亲本组蛋白往后随链的递送，与我们的结论一致【3, 4】。 图2：翘起结构 (Flap)的两个特征：Flap的长度 (A)和相邻Flap的间距(B)（Credit: Science Advances） 综上，李晴课题组应用电镜核酸技术直接观察复制叉滞后链的分子事件，发现Pol32介导了核小体组装，进而提供了冈崎片段合成过程中链置换的终止位置，为冈崎片段成熟和核小体组装协同机制提供直接证据(图3)。 图3：Pol32介导核小体组装与冈崎片段成熟协同机制。(i)　Pol δ催化冈崎片段合成；(ii)　冈崎片段合成后，通过Pol32快速组装H3-H4四聚体到新合成的DNA上；(iii)　Pol δ侵入先前产生的具有新生核小体的冈崎片段；(iv)　冈崎片段合成的重复循环，形成反应核小体间距的flap间距；在Pol32缺失突变体中，核小体组装水平下降导致核小体屏障的减少，进而导致冈崎片段增长。（Credit: Science Advances） 参考文献 1. D. J. Smith, I. Whitehouse, Intrinsic coupling of lagging-strand synthesis to chromatin assembly. Nature 483, 434-U480 (2012). 2. N. C. Koussa, D. J. Smith, Post-replicative nick translation occurs on the lagging strand during prolonged depletion of DNA ligase I in. G3-Genes Genom Genet 11 (2021). 3. C. Tian et al., DNA polymerase delta governs parental histone transfer to DNA replication lagging strand. Proc Natl Acad Sci U S A 121, e2400610121 (2024). 4. A. Serra-Cardona et al., The PCNA–Pol δ complex couples lagging strand DNA synthesis to parental histone transfer for epigenetic inheritance. Science Advances 10, eadn5175 (2024). http://doi.org/10.1126/sciadv.ado1739 责编|探索君 排版|探索君 文章来源|“BioArt” End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell综述