SMG1

引言 蛋白质在细胞中的各种功能执行过程中起着关键作用，系统地研究其功能对于现代生物学来说是一项重要而又复杂的任务。传统的遗传筛查方法，通过基因敲除或抑制来研究基因功能。尽管这些方法非常强大，但通常不能直接揭示蛋白质的具体功能，同时还受到功能冗余和基因必需性的限制。 为了解决这些问题，研究人员开发了基于基因功能充分性的筛选方法。这些方法通过引入开放阅读框（ORF）文库直接评估蛋白质功能。然而，现有的系统方法不仅成本高昂且难以维持，还倾向于偏向较短的ORFs（<5 kb），这是由于DNA合成、克隆、病毒包装和细胞内传递的限制造成的。 随着CRISPR-Cas9技术的发展，基因编辑和基因功能研究取得了显著进展。利用这项技术，研究人员可以精确地在基因组中特定位点引入标签或进行基因敲除，从而研究基因功能。这些技术已经成功应用于多达1300个基因的系统标记。然而，实现全基因组范围的覆盖仍然是一个巨大的挑战，因为许多基因的表达水平或基因长度限制了传统方法的适用性。 在这一背景下，ORFtag技术应运而生。ORFtag是一种创新的方法，通过使用含有启动子、选择基因、功能标签和剪接供体序列的逆转录病毒载体，实现了对内源开放阅读框（ORFs）的融合标记。ORFtag技术的多功能性、成本效益高且效率高，能够在蛋白质组范围内进行大规模平行标记和功能研究。（7月5日Nature Methods “Proteome-scale tagging and functional screening in mammalian cells by ORFtag”） 具体而言，ORFtag通过大规模转染培养的细胞，使ORFtag盒随机整合到基因组中，并通过将功能标签与整合位点下游的剪接受体位点剪接，驱动邻近内源基因座的转录，形成近N端融合蛋白。利用这种方法，研究人员能够在小鼠胚胎干细胞中进行转录激活因子、抑制因子和转录后调控因子的功能筛查。筛查可识别出新的调控因子，包括通过其他方法无法获取的长ORFs。 综上，ORFtag技术的开发和应用，代表了蛋白质功能研究领域的一次重要进步。这一方法不仅为系统地研究蛋白质功能提供了新的工具，还为未来的基因功能研究和蛋白质工程奠定了坚实的基础。通过这种创新技术，研究人员可以在大规模上进行蛋白质功能的高通量筛查，从而更全面地理解蛋白质在细胞生物学中的重要作用。 蛋白质在几乎所有细胞过程中的核心作用，使得系统地研究其功能变得至关重要。然而，现有的方法在确定蛋白质功能方面仍然面临挑战。遗传性功能缺失筛选尽管能够识别参与特定细胞过程的基因，但通常不能直接提供蛋白质功能的深入见解。此外，功能冗余和许多基因的必需性也会限制这些方法的效果。 相比之下，基于充分性的检测方法能够直接确定蛋白质的功能。然而，目前系统的方法依赖于开放阅读框文库（open reading frame libraries, ORFeomes）的传递和表达，这不仅成本高昂且难以维持，还倾向于偏向于较短的ORFs（<5 kb），这是由于DNA合成、克隆、病毒包装和细胞内传递的限制造成的。 通过工程化的本地基因位点可以克服这些限制，最近的CRISPR–Cas9技术已经能够系统地标记多达1300个基因，但实现全基因组覆盖仍然具有挑战性。 为了克服这些挑战，研究人员开发了一种名为ORFtag的创新技术。ORFtag是一种多功能、成本效益高且效率高的方法，能够在蛋白质组范围内进行大规模平行标记和功能研究。ORFtag使用含有启动子、选择基因、功能标签和剪接供体序列的逆转录病毒载体。通过大规模转染培养的细胞，ORFtag盒随机整合到基因组中，并通过将功能标签与整合位点下游的剪接受体位点剪接，驱动邻近内源基因座的转录，形成近N端融合蛋白。 具体来说，ORFtag是基于逆转录病毒载体，这些载体包含一个启动子、一个选择基因和一个功能标签。标签后面接一个剪接供体序列。大规模转染培养的细胞后，ORFtag盒随机整合到基因组中，通过将功能标签与整合位点下游的剪接受体位点剪接，形成近N端融合蛋白。 在该研究中，研究人员通过三种不同的筛查方法验证了ORFtag的效用： 转录激活因子筛查：将蛋白质与细菌四环素阻遏蛋白（TetR）的DNA结合域融合，使其能够招募到整合的绿色荧光蛋白（GFP）报告基因上游的TetO结合位点。通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选出GFP表达增加的细胞，鉴定出转录激活因子。 转录抑制因子筛查：使用构建的报告基因使GFP报告基因持续活性，通过FACS筛选出GFP表达减少的细胞，鉴定出转录抑制因子。 转录后基因调控因子（PTGR）筛查：将候选ORFs与lambda噬菌体N（λN）蛋白融合，使其能够招募到在报告基因3'非翻译区（UTR）中的boxB位点。通过筛选GFP表达减少的细胞，鉴定出在转录后水平上调控GFP表达的蛋白质。 ORFtag是蛋白质组功能筛查的多功能工具（Credit: Nature Methods） 图a. ORFtag方法的总体概述。ORFtag基于逆转录病毒载体，这些载体包含一个强启动子（Pstrong）、选择基因（NeoR）和功能标签。标签后面接一个剪接供体序列。在大规模转染的细胞中，ORFtag盒随机整合到基因组中，通过将功能标签与整合位点下游的剪接受体位点剪接，形成近N端融合蛋白。 图b. 三种不同的筛查方法。转录激活因子筛查：融合的蛋白质与TetR（细菌四环素阻遏蛋白）的DNA结合域融合，使其能够招募到TetO结合位点上游的GFP报告基因。通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选出GFP表达增加的细胞，鉴定出转录激活因子。转录抑制因子筛查：构建的报告基因使GFP报告基因持续活性，通过FACS筛选出GFP表达减少的细胞，鉴定出转录抑制因子。转录后基因调控因子（PTGR）筛查：候选ORFs与lambda噬菌体N（λN）蛋白融合，使其能够招募到报告基因3'非翻译区（UTR）中的boxB位点。通过筛选GFP表达减少的细胞，鉴定出在转录后水平上调控GFP表达的蛋白质。 图c. ORFtag整合位点的基因组信息，显示了在Yap1（转录激活因子）、Zfp57（转录抑制因子）和Cnot9（PTGR因子）等基因座的插入位点。结果表明，在这些基因座存在显著的筛查特异性的插入富集。 图d. 火山图（volcano plot），突出显示了已知和新发现的筛查结果。 通过这三种筛查方法，研究人员发现了显著的、筛查特异性的插入富集，例如： 转录激活因子筛查：Yap1（转录共激活因子） 转录抑制因子筛查：Zfp57（含KRAB域） PTGR筛查：Cnot9（mRNA去腺苷化酶复合物亚基） 使用严格的阈值（FDR < 0.1%，log2比值≥1）确定了139个潜在的转录激活因子，207个抑制因子和77个PTGR蛋白。激活因子靶蛋白包括几个已知的转录激活因子，如p65、Ep300、Mediator复合物亚基和所有Kmt2(a-d)组蛋白甲基转移酶，这些因其长ORFs（长达17 kb）无法通过传统方法筛查。抑制因子靶蛋白包括75个KRAB锌指抑制因子及其共抑制因子Trim28、HP1家族蛋白、H3K9甲基转移酶和Polycomb抑制复合物组件。PTGR筛查识别出microRNA路径（Ago2、Tnrc6a/b/c）和无义介导降解路径（Smg1、Smg9、Upf2）的核心组件，以及Ccr4-Not去腺苷化复合物（Cnot2、Cnot3、Cnot9）和翻译抑制剂（Eif4e2、Eif4enif1）。 ORFtag方法在蛋白质功能研究中的高特异性（Credit: Nature Methods） 实验设计与数据分析 不同筛查结果的重叠性： 图a展示了转录激活因子（绿色）、转录抑制因子（蓝色）和转录后基因调控因子（PTGR，黄色）筛查靶蛋白的重叠性。结果显示，三种筛查的靶蛋白几乎没有重叠，表明ORFtag不导致非特异性基因的反复和人为检测。 筛查靶蛋白的功能富集： 图b显示了筛查靶蛋白在人类同源基因中的富集情况，包括DNA结合域、激活域、抑制域和RNA结合蛋白。此外，激活因子筛查靶蛋白显著富集于ORFeome激活因子，尽管重叠有限。 功能领域的富集： 图c展示了激活因子、抑制因子和PTGR筛查靶蛋白的蛋白质结构域、生物过程和细胞成分的GO富集情况。结果显示，这些基因均与其相关的功能一致，进一步验证了筛查结果的特异性。 实验验证 独立验证筛查靶蛋白： 图2d展示了对选定筛查靶蛋白的独立验证结果。通过流式细胞术检测GFP强度，结果显示所有测试候选蛋白质，包括先前未与相应生物过程相关联的靶蛋白，均能够在招募实验中验证其功能。例如：骨架蛋白Pxn或未表征蛋白1700102P08Rik的招募足以强烈激活转录。E3泛素连接酶Trim8和未表征蛋白Msantd3的招募则足以抑制转录。神经活动相关蛋白Maco1和E3泛素连接酶Trim13在招募到mRNA的3'UTR时能够抑制报告基因表达。 未表征蛋白质的细胞功能分配： 为评估ORFtag在未表征蛋白质细胞功能分配中的潜力，进一步研究了锌指蛋白Zfp574的内源功能。ORFtag筛查特异性地将Zfp574识别为转录激活因子。使用生长素诱导降解系统（AID），结果显示Zfp574的耗竭导致显著的生长缺陷，表明Zfp574对细胞适应性至关重要。快速耗竭Zfp574后进行的PRO-seq进一步揭示了Zfp574严格作为转录激活因子的作用，这与ORFtag的结果一致。通过Cut&Run技术识别了Zfp574的140个基因组结合位点，其中大多数（87.9%）位于基因转录起始位点（TSS）附近，表明Zfp574作为选择性转录激活因子，特异性地结合并激活一小部分支持细胞适应性的基因。 为了验证筛查结果，研究人员选择了每个筛查中的八个，跨越广泛的富集得分，重点是尚未证明直接功能的蛋白。通过单独克隆和转染每个筛选出的蛋白，发现所有测试的候选蛋白质，包括先前未知的调控因子，都能够在招募实验中验证其功能。例如：Pxn和1700102P08Rik蛋白质的招募足以强烈激活转录。Trim8和Msantd3的招募则足以抑制转录。Maco1和Trim13在招募到mRNA的3'UTR时能够抑制报告基因表达。 为了评估ORFtag在未表征蛋白质的细胞功能分配中的潜力，研究人员进一步研究了Zfp574的内源功能。ORFtag筛查特异性地将Zfp574识别为转录激活因子。使用生长素诱导降解系统（AID），显示Zfp574的耗竭导致显著的生长缺陷，表明Zfp574对细胞适应性至关重要。快速耗竭Zfp574后进行的PRO-seq进一步揭示了Zfp574严格作为转录激活因子的作用，这与ORFtag的结果一致。通过Cut&Run技术识别了Zfp574的140个基因组结合位点，其中大多数（87.9%）位于基因转录起始位点（TSS）附近，表明Zfp574作为选择性转录激活因子，特异性地结合并激活一小部分支持细胞适应性的基因。 ORFtag的多功能性和高效性使其成为研究蛋白质功能的一种强有力工具。通过这种创新技术，研究人员可以大规模进行蛋白质功能的高通量筛查，从而更全面地理解蛋白质在细胞生物学中的重要作用。ORFtag不仅为系统地研究蛋白质功能提供了新的工具，还为未来的基因功能研究和蛋白质工程奠定了坚实的基础。通过这种创新技术，研究人员可以更深入地了解蛋白质在细胞过程中的具体角色，从而推动生命科学研究的不断发展。 参考文献 Nemčko F, Himmelsbach M, Loubiere V, Yelagandula R, Pagani M, Fasching N, Brennecke J, Elling U, Stark A, Ameres SL. Proteome-scale tagging and functional screening in mammalian cells by ORFtag. Nat Methods. 2024 Jul 5. doi: 10.1038/s41592-024-02339-x. Epub ahead of print. PMID: 38969721. https://www.nature.com/articles/s41592-024-02339-x 责编|探索君 排版|探索君 转载请注明来源于【生物探索】 End 往期精选 围观 一文读透细胞死亡(Cell Death) | 24年Cell重磅综述（长文收藏版） 热文 Cell | 是什么决定了细胞的大小？ 热文 Nature | 2024年值得关注的七项技术 热文 Nature | 自身免疫性疾病能被治愈吗？科学家们终于看到了希望 热文 CRISPR技术进化史 | 24年Cell 综述

A new study led by scientists at the Institute of Cancer Research, London (ICR) and The Royal Marsden NHS Foundation Trust has shown how stomach cancers can evade the effects of a new class of drugs, raising the possibility of being able to predict drug resistance in advance. The researchers found that stomach cancers could develop resistance to ATR inhibitors by switching off the activity of two genes, meaning genetic tests could be used in the future to select patients whose cancers are most likely to respond to this class of drugs. Study leader Chris Lord, professor of cancer genomics at the ICR, London, said the discovery could “lay the groundwork for future clinical trials to test out new drug combinations and other treatment approaches designed to overcome cancer’s drug resistance”. ATR inhibitors work by blocking a protein called ATR, which usually helps cancer cells repair their DNA and plays an important role in cell division. When ATR is blocked, cancer cells accumulate DNA damage and eventually die. The study, published in the journal Cancer Research , involved the use of the gene editing technology CRISPR to break or switch off each of 25,000 genes in cancer cells treated with ATR inhibitors in order to identify which genes contributed to drug resistance. The researchers found that when either of two genes called SMG8 or SMG9 were switched off, cancer cells remained able to repair their DNA even in the presence of ATR inhibitors and also led to increased activity of another gene called SMG1, which further drove drug resistance. They also found that ATR inhibitors lost their ability to rein in cell division in cancer cells which had SMG8 or SMG9 mutations. The researchers now want to determine whether the results hold promise for patients treated in the clinic – with those whose cancers have genetic defects in SMG8, SMG9 or SMG1 responding differently to ATR inhibitors. Also commenting on the findings of the study, Dr Irene Chong, senior author and consultant clinical oncologist and clinician scientist at The Royal Marsden NHS Foundation Trust, said: “As a clinician who treats gastric cancer, I am acutely aware that new strategies are urgently required for patients with limited treatment options. “Our study shows that ATR inhibitors may represent an important therapeutic option for subgroups of patients with gastric cancer, and our work identified a novel mechanism of resistance, which could help us understand how we are able to overcome drug resistance. This could ultimately lead to new treatment strategies in the future."