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这篇文章于2025年发表在Stem Cell Reviews and Reports，全面评估了临床级MSC可扩展生产的自动化制造工艺和平台。摘要：     间充质干细胞/基质细胞（MSC）具有卓越的再生和免疫调节特性，因此在再生医学方面具有巨大的潜力。然而，它们的治疗应用需要在严格的监管标准和良好生产规范（GMP）指南下进行大规模生产，这带来了重大挑战。本综述全面评估了临床级MSC可扩展生产的自动化制造工艺和平台。分析了各种大型培养容器，包括多层培养瓶和生物反应器，它们在MSC扩增中的功效。此外，还回顾和比较了自动化MSCs生产平台，如Quantum®细胞扩增系统、CliniMACSProdigy®、NANT001/XL、CellQualia™、Cocoon®平台和Xuri™细胞扩增系统W25。我们还强调了优化培养基的重要性，特别强调从胎牛血清转向人源化或无血清替代品，以满足GMP标准。此外，还讨论了替代冷冻保存方法和控速冷冻系统的进展，这些方法为MSC保存提供了有希望的改进。总之，推进自动化制造工艺和平台对于实现基于MSC的再生医学的全部潜力和满足对基于细胞的疗法日益增长的需求至关重要。强调涉及行业、学术界和监管机构的合作举措，以加速基于MSC的疗法向临床实践的转化。1.背景介绍     间充质干细胞/基质细胞（MSC）是一种存在于各种组织中的多能成体干细胞，包括骨髓、脂肪组织和脐带。它们具有显着的自我更新和分化能力，使它们能够产生各种细胞类型，如成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞。此外，MSC分泌多种生物活性分子，包括生长因子、细胞因子和细胞外囊泡，有助于组织修复和再生。这些旁分泌因子发挥抗炎、抗凋亡和促血管生成作用，促进各种损伤和疾病的组织愈合。此外，使MSC对治疗应用具有吸引力的关键特征之一是其免疫调节特性。MSC已被证明可以通过抑制各种免疫细胞（包括T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞）的增殖和功能来抑制免疫反应。这种免疫调节作用使MSC成为治疗各种自身免疫性疾病、移植物抗宿主病（GVHD）和炎症综合征的有希望的候选者。因此，MSC为再生医学、组织工程和自身免疫性疾病的治疗提供了一条有前途的途径，因此在解决未满足的医疗需求方面具有巨大潜力。     由于MSC的生产被视为ATMP（先进疗法药品），因此其应用由特定的监管框架控制。MSC生产需要符合当前良好生产规范（GMP）标准的大规模细胞扩增系统。GMP指南是由政府监管机构制定的严格法规，例如美国的食品药品监督管理局（FDA）或欧洲药品管理局（EMA），旨在确保药品（包括基于MSC的产品）的质量、安全性和有效性。考虑到基于MSC的疗法涉及事后无法过滤或灭菌的活细胞的给药，MSC生产的首要GMP先决条件是具有受控无菌和多级无菌保护解决方案的环境。洁净室设施、无菌防护服、层流罩和封闭培养系统共同参与其中，以限制空气中的颗粒数量并避免最终产品受到污染。最后但并非最不重要的一点是，训练有素、组织有序、了解制造过程的员工对于不伤害患者也很重要。      基于MSC的疗法的生产过程包括供体和MSC来源选择、细胞分离和扩增、质量控制以及扩增细胞的进一步移植等步骤。将MSC用于治疗目的的关键挑战之一是能够在保持其特性和功能特性的同时大量扩增它们。一般来说，天然组织和收集的生物材料中MSCs的初始频率非常低——据报道，骨髓中每104-105个单核细胞或脂肪抽吸物中每102-103个细胞中MSC少于或大约1个。传统的MSC体外扩增至临床相关产量（数百万至数亿个细胞）通常非常耗时、劳动密集型，并且需要大量的培养箱空间。因此，它不仅效率低下，而且还可能损害扩增的MSC的质量。重要的是，以前的研究报道了MSC在晚期传代中的增殖和分化能力下降。      MSC制造过程的另一个组成部分是最终产品的质量控制。这包括细胞活力、表型标志物、分化潜能和无微生物污染的检测，以评估制造细胞产品的纯度、特性、效力和安全性。根据国际细胞治疗学会（ISCT）的规定，MSC必须满足以下方面：（I）塑性粘附性，（II）CD105、CD73和CD90等分化簇（CD）分子表达阳性，缺乏CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α和人类白细胞抗原（HLA）-DR的表达，（III）在体外分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞[9].然而，为了确保MSC的安全性和功能性，应进行免疫调节活性和基因组稳定性的额外测试。2.MSC生产平台     大规模生产临床级MSC的生物工艺策略是一个复杂的过程，对封闭和无菌环境有很高的要求。因此，MSC加工必须在符合GMP的专用设施中进行，以最大限度地降低物理屏障和空气过滤污染的风险。为了响应该领域的客户需求，一些制造商正在开发和引入用于自动和密闭细胞培养的新技术，例如量子®细胞扩增系统（TerumoBCT）、CliniMACSProdigy®（MiltenyiBiotec）、NANT001/NANTXL系统（VivaBioCell）、CellQualia™（Sinfonia技术）、Cocoon®平台（Lonza）或Xuri™细胞扩增系统W25（Cytiva）（图1）.生物反应器的利用在扩大基于细胞的疗法的可及性方面具有巨大潜力，特别是对于缺乏现场GMP合规实验室的中心。这些生物反应器为细胞培养和扩增提供了受控的环境，确保了细胞生产过程的一致性、可重复性和质量。通过使用生物反应器，没有GMP设施的中心仍然可以生产临床级细胞，从而将基于细胞的治疗范围扩大到更多患者。图1：大规模生产临床级间充质干细胞/基质细胞（MSC）的生物加工策略的复杂概述。MSC扩增平台（Quantum®细胞扩增系统、CliniMACSProdigy®、NANT001/XL、CellQualia™、Cocoon®平台和Xuri™细胞扩增系统W25）需要以下输入：样品或分离的细胞、培养基、洗涤试剂（磷酸盐缓冲盐水）、解离试剂（胰蛋白酶、TrypLE）和可选添加剂。细胞收获、质量控制（最终产品的纯度、特性、效力和安全性）、冷冻保存和产品配方等下游工艺也是临床级MSC生产的重要组成部分。     Terumo-BCT开发的量子®细胞扩增系统代表了一种利用中空纤维生物反应器的自动和闭式细胞培养的替代策略。此外，该设备以适合细胞培养过程的速率提供连续的培养基更换。生物反应器本身的面积为21,000cm2，相当于120个T-175培养瓶。值得注意的是，在细胞接种前，该生物反应器的中空纤维必须涂有粘合基材，如纤连蛋白、波形蛋白或冷沉淀物（通常来自多个供体的血液）。迄今为止，已有多达25项实验研究测试了Quantum®细胞扩增系统用于成人MSC扩增，使其成为贴壁细胞使用最广泛的生物反应器系统。此外，在比较脂肪组织来源的MSC（AT-MSC）的产量和群体倍增时，Quantum®优于基于培养瓶的手动培养，因此适用于大规模生产。此外，用人血小板裂解物（hPL）取代胎牛血清（FBS）作为生长补充剂，可显著增强AT-MSC在Quantum®内的扩增，同时保持其质量。例如，以20×106的密度加载到Quantum®中，来自骨髓的解冻MSC（BM-MSC）（在第2代）（在第2代）扩增7天，产量为100–276×106。此外，几项研究表明，能够在体外抑制T淋巴细胞活化的量子®扩增BM-MSC可以保持免疫调节功能。此外，Quantum®系统可以直接连接到任何气体及其组合，从而提供常氧或低氧微环境。Hanley等人观察到，与Quantum®和缺氧扩增的BM-MSC相比，培养瓶和常氧培养的BM-MSC的生产率较低。另一方面，加强对乳酸和葡萄糖水平的监测，再加上Quantum®生物反应器内新鲜培养基的持续供应，很可能促进了卓越的存活率和整体生长。通常，与基于培养瓶的增殖相比，Quantum®减少了所需的传代次数（减少到一半）和开放作（从54400个步骤减少到133个步骤）。此外，他们的研究还声称量子®扩增BM-MSCs在缺血性卒中大鼠模型中的治疗效果。另一项研究揭示了源自脐带组织（UC-MSC）的Quantum®制造的MSC和移植到诱导膝关节关节表面缺损小鼠身上的BM-MSC的愈合能力。采用Quantum®生物反应器系统的临床试验探索了GVHD、2型糖尿病、帕金森病、高级别神经胶质瘤、缺血性心脏病、中风和急性呼吸窘迫综合征等疾病的治疗方法。利用各种MSC类型，包括BM-MSC、AT-MSC或神经MSC，这些试验证明了使用Quantum®系统在不同剂量和给药途径下产生的细胞的安全性、耐受性和有效性。  来自MiltenyiBiotec的CliniMACSProdigy®设备利用ACC（贴壁细胞培养）工艺和适当的管路组（TS730），可实现自动MSC分离（通过骨髓样本的密度梯度离心）、接种、培养、培养基更换、繁殖和收获。Godthardt等人展示了该系统的大规模和临床级效率以及特定MSC-BrewGMP培养基的使用。此外，他们声称原代组织分离的BM-MSC以及AT-MSC或UC-MSC的单细胞悬液可以由CliniMACSProdigy®处理。此外，据报道，使用1层CellSTACK®的10天程序能够产生100多个集落，由29至5000万个MSC（第零代–P0）组成，这些集落是从马电针动员的外周血样本中分离出来的。分离的MSC具有特征性的成纤维细胞样形态和MSC表型特征。重要的是，与手动方案相比，Prodigy系统在P0收获的MSC数量显著更高，并且通过随后的手动传代提高了纯度，P3中CD73、CD90和CD105的阳性率达到95%。在制造商研究中，人骨髓单核细胞最初接种在1层CellSTACK®腔室中。然后在CliniMACSProdigy®系统内使用MSC-BrewGMP培养基洗涤、培养和扩增这些细胞，并将其扩增成三个5层CellSTACK®腔室。为了进行比较，使用T175培养瓶进行手动扩增过程。扩增14天后，CliniMACSProdigy®系统产生3.8×10⁸个BM-MSC（第2代），而手动过程在同一传代下产生4.5×10⁸个细胞，表明自动和手动方法之间的细胞数量相似。然而，平台复杂性和高耗材价格使CliniMACSProdigy®成为昂贵的制造选择，尤其是对于小规模MSC增殖。     NANT001或XL系统提供了另一个平台，在XL系统的情况下，包含一个CellSTACK®（636cm2）或两个互连的细胞培养容器（T-175和3180cm2的5层培养瓶）。与CliniMACSProdigy®不同，该系统不需要外部培养箱。另一方面，它的产能较低，但足以满足中小批量的自体生产。此外，它还允许对过程控制信息（例如温度、pH值、汇合度和细胞分离）进行智能和远程监控。NANTCartridge是一个封闭系统，由四个通过无菌连接器易于连接的部分组成[23]。Fitzgerald等人测试了NANT001系统在符合GMP的要求下生产来自健康供体的自体AT-MSC的效率。手动和自动过程同时进行，将加工后的基质血管组分（SVF）的细胞以4,000个细胞/cm2的密度放入一个636cm2的CellSTACK®培养室中。总体积为150mL的培养基由补充有5%hPL和1U/mL肝素的最低必需培养基（α-MEM）的α改良型组成。用150mL磷酸盐缓冲盐水洗涤培养样品，然后在第1天、第3天和50%汇合时更换培养基。在达到90%汇合度24小时后，用50mL重组TrypLE溶液收获扩增的细胞。来自三次验证运行的数据显示，分别持续6-8天和7-9天的手动和自动过程的细胞产量（平均2.7×107）和活力（>90%）相当。此外，两种扩增的AT-MSC都具有MSC表型特征以及与脂肪细胞和骨细胞相似的分化能力。      CellQualia™代表了另一个由Sinfonia技术设计的智能细胞处理系统。该系统使用两个细胞培养单元以及从1层到5层（CellSTACK）®和36层（HYPERStack®）腔室的自动传代，实现MSC的紧密和自动化生产。分析技术的内置过程通过对自动采集的样品进行在线（温度、CO2、形态、pH、葡萄糖和乳酸）和离线分析，确保高水平的质量控制。通过监测乳酸水平随时间的变化，可以间接评估细胞生长和增殖动力学。一旦乳酸水平达到表明最佳细胞密度的某个阈值，系统就会表明需要自动传代。此外，犬尿氨酸的积累和低水平2-氨基己二酸的维持表明细胞在整个过程中保持未分化状态。Hosoya等人证实了CellQualia™连续繁殖的MSC的塑料粘附和表型特征，这些MSC对MSC特异性标志物CD105、CD73和CD90呈阳性。然而，该研究缺乏对MSCs阴性标志物及其分化能力的评估。从2×10开始，该公司表示，在培养2次传代和6天后，MSC产量相当于1×108个细胞。     Lonza推出的Cocoon®平台旨在满足自体（患者规模）细胞疗法的生产要求。该系统使用封闭的一次性盒，为培养锚依赖性或独立细胞提供平面或体积空间。在包埋盒内，热障将温暖和寒冷区域分开，确保细胞培养（37°C）和试剂储存（4°C）的最佳条件。此外，该盒还配备了pH和溶解氧传感器，可在制造过程中实时记录数据。该平台是可定制的，易于使用，并且需要最少的作员干预，但是，目前其广泛的实施尚不清楚。     由Cytiva开发的Xuri™细胞扩增系统W25代表了细胞治疗生物工艺的飞跃。该系统采用单向WAVE™摇摆技术和各种培养体积（从300mL到25L），适用于小规模研究或大规模临床生产。WAVE™技术提供的轻柔摇动运动增强了营养物质的分布和气体交换，这是维持最佳细胞生长和活力的关键因素。专为免疫治疗中不依赖贴壁的细胞（嵌合抗原受体T细胞）的可扩展扩增而设计，但也可以参与微载体上的MSC生产。Silva等人在小体积接种到2L细胞袋的CultiSpher-S微载体上进行了UC-MSC的扩增，并在最初的24小时内保持静止。之后，在600mL培养基中的摇摆培养物中扩增UC-MSC。总体而言，该系统产生的膨胀系数范围为12.3至24.8。重要的是，摇摆培养中采用的动态条件不会对扩增细胞的质量产生负面影响，这通过各种质量控制措施（包括活力、表型保留和分化潜力）得到验证。有趣的是，另一项研究发现，在摇摆生物反应器中自发产生的MSCs聚集体表现出增加的干性、迁移特性和血管生成因子表达，从而提供了更高的治疗潜力。总体而言，Xuri™细胞扩增系统W25是一种多功能且高效的MSC扩增工具，为研究和临床应用提供了可靠的解决方案。3.细胞培养容器的放大    多层培养瓶是大规模MSC生产的重要组成部分，与传统使用的T-25、T-75和T-175培养瓶相比，其表面积更大（表1），从而减少了MSC的广泛传代培养。通常，放大涉及使用更大的生物反应器来提高生产能力，需要进行大量优化以保持更大体积的细胞质量。相比之下，横向扩展通过添加更多相同大小的生物反应器来扩大容量，确保各单元的条件一致，但需要更多的空间和资源。在放大和横向扩展之间进行选择取决于生产目标、预算和保持细胞一致性的能力等因素。如今，多层培养瓶是最有效的大规模策略之一，据报道其扩增率为100倍甚至更高。另一方面，随着细胞培养过程扩大到更大的容器尺寸，在整个生产过程中保持无菌和均一的培养环境变得越来越具有挑战性。表1.Corning和ThermoFisher不同多层培养瓶的生长面积   CellSTACK®多层培养瓶（Corning）和Nunc™CellFactory™系统（ThermoFisher）就是此类容器的示例，它们由堆叠在一起的多层细胞培养表面组成。它们都有5种尺寸，从1到40层不等，每层提供636厘米和632厘米的生长面积2。据报道，对于2室CellSTACK®，在5天的培养过程中，最终细胞产量为2.84×108（WJ-MSCs（沃顿氏果冻-MSCs）和4.69–5.65×107（BM-MSCs）。比较这两项独立研究，初始接种的细胞数量存在显着差异，范围为1000至4000个细胞/cm2，导致计算的扩增率存在195.28倍和9.22-11.10倍的巨大差异。同样，两位独立作者使用4室Nunc™CellFactory™在收获时获得了不同的细胞产量，对应于扩增的BM-MSC×7.8×108和2.5108。最后，在5腔CellSTACK®中培养牙髓来源的MSC（DP-MSC）11天，分别产生3.2×108个细胞在补充FBS和hPL的培养基中培养的108个细胞。总体而言，接种密度、培养基、某些添加剂和培养时间等细胞培养参数会影响给定系统的细胞产量。此外，康宁的CellBIND®表面处理通过增加聚苯乙烯细胞培养容器的亲水性来增强细胞粘附和生长，使其更有利于多种细胞类型。这种处理确保了一致、稳健的细胞培养条件，这对无血清或低血清培养基应用特别有益。  HYPERFlask®和HYPERStack®容器采用独特的细胞-介质环境气体交换技术，通过透气材料消除容器内的内部顶部空间。在补充有15%人AB血清的α-MEM中，以2×103个细胞/cm2的浓度接种10层HYPERFlask®（1720cm2）（共3.44×106个细胞）中，从人脐带基质（UCM-MSCs）衍生的扩增MSC能够在培养11天后产生4.5×107个细胞，相当于12.99的扩增率。HYPERStack®由Stackettes组成–一个单独的细胞培养室，由顶板和透气膜组成。每个Stackette拥有500cm2的生长面积，它们通过两个（液体和空气）歧管互连，形成一个模块，每个Stackette之间有一个露天气管空间。因此，HYPERStack®的12层和36层模块（相当于6000和18000cm2）具有与传统的2层和10层堆叠培养容器相同的体积占地面积。从而最大限度地减少培养空间，同时满足培养细胞的代谢需求。Sherman等人进行的初步数据显示，以3×103个细胞/cm2的密度接种BM-MSCs扩增5天后，可以®产生8.7亿个细胞的平均收获产量（扩增比为16.11）。      康宁®CellCube®系统为贴壁细胞培养提供了一个新颖、稳定且可扩展的平台。其模块化设计由平行的10、25或100个聚苯乙烯板组成，可在紧凑的占地面积中提供8500至85000cm2的大生长表面积。在CellCube®系统内，在每个培养板的两侧接种和培养细胞，使培养空间加倍。接种过程需要优化贴壁时间和系统的多次垂直旋转，以均匀接种细胞。此外，内置蠕动泵和一次性生物反应器可确保高效的连续流体再循环，以实现最佳的气体和营养物质输送。CellCube®系统的这种基于灌注的设计创造了一个与体内条件非常相似的环境，从而提高了细胞生产率。提供的信息概述了HEK293T和Vero细胞培养物在100层CellCube®模块中的成功扩增，展示了对培养条件的严格控制以及使用代谢物分析来确定收获时间。HEK293T和Vero细胞培养物均能有效扩增，分别×10个10个细胞的产量达到1.4和1.1。4.优化MSC生产：利用符合GMP要求的血清和无血清培养基     工艺验证是药物开发中的关键步骤，在此期间，必须仔细评估可能危及产品安全性的培养基、添加剂和材料的使用。例如，使用动物源性添加剂存在病原体传播的风险，需要进行彻底的风险分析并考虑替代添加剂。选择合适的培养基对于MSC的扩增和质量是必不可少的，尤其是在临床目的的大规模生产中。FBS作为富含生长因子和营养物质的天然补充剂，在许多实验室应用中用于细胞体外扩增，有着悠久的历史。然而，使用FBS培养旨在进一步用于治疗应用的MSC会带来重大风险，这主要是由于牛病毒、朊病毒和人畜共患病原体的潜在污染，这些物质可能会引发人类的免疫反应。在GMP级MSC生产中，利用经验证的FBS彻底检查免疫调节剂的存在，对于维持质量标准至关重要。γ辐照处理被认为是防止FBS中病毒污染的最佳方法之一，它与GMP流程一致。然而，采用无异种成分（xeno）的培养基，如富含人源物质的含血清培养基或无血清和无异种成分的培养基（SXFM），是符合GMP要求的MSC生产的最佳选择。将人类成分而不是动物衍生物加入培养基中，可确保符合细胞扩增过程的GMP指南。目前，包括人血清、脐带血血清、富血小板血浆和hPL的人源化补充剂被用作FBS的替代品（表2）。尽管自体人血清是MSC扩增的最佳选择，但获得足以产生临床相关量MSC的血清将具有挑战性。然而，来自多个供体的混合同种异体人血清可能有助于克服这一限制并促进MSC的大规模生产。尽管如此，人源补充剂（例如自体人血清）还有下一个显着的缺点，即从一个批次到另一个批次观察到的显着差异。尽管这些变化可以通过每批生产大型供体库来减轻，但它们同时也增加了可能因人类病毒而引起的感染风险。因此，这些障碍可能对大规模临床试验中MSCs的充分扩增和相关治疗效果构成重大挑战。     为了在不使用任何动物产品的情况下获得安全的人类产品，研究人员使用psoralen或核黄素灭活的hPL作为FBS的替代品，验证了在GMP条件下生产MSC。这种方法保留了MSC的多能和免疫调节能力。Mareschi等人使用hPL而不是FBS从5个骨髓样本中分离MSC。他们研究了一种新的hPL生产方法，该方法涉及用Ca-Gluconate处理血小板池以形成凝胶凝块，然后机械挤压以释放生长因子。将通过冻融循环和添加肝素获得的标准hPL（hPL-E）与新的hPL（hPL-S）没有血小板或纤维蛋白原，但含有相似数量的蛋白质和生长因子。hPL-S需要更少的生产步骤来符合GMP条件，保持干细胞标志物，并显示出显着差异，例如HLA-DR表达较低，使其成为MSC生产的有效替代方案。目前，有几种市售的病毒灭活GMPhPL以及最终的商业产品，如人血小板裂解物（生命科学生产）、血小板裂解物MultiPLi（Macopharma）和PLUS™GMP级（CompassBiomedicalInc）。此外，与hPL相关的污染风险得到有效管理。例如，自2018年以来，法国的所有血小板浓缩物都经过补骨脂素处理，以降低微生物污染的风险。另一种消除潜在病原体的方法是在使用hPL之前对其进行伽马射线照射[57]。然而，与hPL产品生产相关的一个重大限制是必须确保血小板供体的充足供应。管理符合GMP的培养基的补充选择是使用合成的、化学成分明确的培养基，例如BDMosaic™间充质干细胞无血清（BDBiosciences）、MesenCult-XF™（StemCellTechnologies）、MSCNutriStem®XF（生物工业）、无血清成分确定的细胞培养物（TNCBioBV）等。上述培养基的成分仅由已知化合物组成，使其成为FBS的潜在可取替代品。尽管如此，它们特别适用于研究目的，因为它们需要不断开发和改进以维持关键的细胞功能，例如粘附、分化、免疫调节和其他基本过程。用于优化和可重复的MSC生产的下一组培养基是具有高质量成分的无血清、无异种成分配方，例如MSC-BrewGMP培养基（MiltenyiBiotec）和StemProMSCSFMXenoFree™（Invitrogen）等。然而，化学成分明确的培养基的一个关键限制是由于缺乏附着因子，MSC增殖缓慢或有限，以及细胞对底物的粘附不足。因此，使用某些培养基需要在塑料表面预涂特定物质，以确保最佳的细胞附着和生长。另一方面，补充人血浆衍生物的StemProMSCSFM™（LifeTechnologies）等培养基对于无包被的MSC培养来说并不是最佳。MSC-BrewGMP培养基（MiltenyiBiotec）是市场上唯一一种符合GMP要求的SXFM，因为它是袋装的，用于封闭系统培养，不需要表面涂层。最常用的分子，如纤连蛋白、层粘连蛋白和肽，用于表面改性，通过引入正表面电荷来促进细胞生长，从而增强粘附力。表2：用于 GMP 级 MSC 生产的培养基     比较补充动物或人血清的不同培养基类型与无血清培养基（SFM）的效果，可得出对MSC特性的显著结果。Dreher等人证明，与在10%FBS中培养的AT-MSC相比，在补充有10%人血清的培养基中培养的AT-MSC在应用后在非肥胖糖尿病免疫缺陷小鼠肺和肝脏中的存在减少。总之，在人血清存在下培养的AT-MSC在特异性粘附和细胞外基质相关分子的下调方面表现出有趣的变化。他们认为整合素α6（CD49f）表达的降低可能与对层粘连蛋白的粘附减少有关。尽管如此，减少间充质干细胞在肺部的滞留可能会降低肺栓塞的风险。细胞扩增培养基的选择在影响MSC的增殖动力学等特性方面起着关键作用。多项实验研究揭示了各种培养基类型对MSC特性和培养动力学的显着影响。Wuchter等人进行了一项比较分析，研究了三种符合GMP的培养基对MSC扩增的影响：补充有10%混合hPL的基础培养基（Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）-低葡萄糖）、StemPro®MSCSFMCTS（Invitrogen）（用于人离体组织和细胞培养加工应用）和补充有10%FBS的非XFMSCGM™（Lonza）（仅供研究应用）。最显着的差异出现在延长培养（50天）后BM-MSCs的大小和增殖动力学。StemPro®MSCSFMCTS显著促进了生长，与其他MSC相比，产生的MSC具有更小但高度均匀的形态。在hPL培养基中培养的BM-MSCs表现出明显的突起，但与在含有FCS的MSCGM™中培养的BM-MSC相比更小。然而，与在MSCGM™中培养相比，用hPL培养基培养的MSC观察到的生长增加略大。血小板裂解物对MSCs扩增的促进也与其他研究的结果一致。此外，Poloni等人证明，在含有10%混合同种异体人血清的Iscove改良Dulbecco培养基中培养的CD271阳性BM-MSC与在补充动物血清的培养基中培养的培养基相比，表现出相当的分化能力以及表面和基因标志物的表达。此外，未观察到核型改变。他们还证明，使用CD271选择的细胞和混合的同种异体人血清，仅30天内从5mLBM抽吸物中细胞产生显着增加到临床显着水平（10×10^8MSC）[66]。此外，SFM的使用也对MSC的特性产生了显着影响。例如，PRIME-XVSFM（IrvineScientific）已被证明可以增强人BM-MSC中的集落形成能力，提高成骨潜力，并增加群体倍增。因此，它是动物血清的优质替代品。尽管基于FBS的培养基和PRIME-XVSFM的渗透压相似（分别为0.31和0.29Osmol/kg），但SFM更接近人类生理条件，因此被认为对细胞有更好的影响。此外，Aussel等人证明，SXFM，特别是MSC-BrewGMP培养基（MiltenyiBiotec），显著影响MSC的克隆形成效率。具体来说，与传统的AT-MSC和BM-MSChPL培养基相比，SXFM条件下的菌落大小和密度增加。     值得注意的是，用于收获和分离用于临床应用的MSC的其他补充试剂也必须满足所有安全标准。目前，大多数临床研究使用猪来源的胰蛋白酶进行细胞分离制备。然而，为了优化该程序，使用TrypLE（Gibco，ThermoFisherScientific）或TrypZean（Sigma-Aldrich）等重组胰蛋白酶是有利的，因为它们对细胞的影响更温和，并且与猪来源的胰蛋白酶相比不存在异种蛋白。对于GMP条件下的酶组织消化，建议使用GMP级胶原酶而不是I型胶原酶，因为后者可能含有可能携带传染源的成分。出于这些目的，例如，源自溶组织梭菌的胶原酶NB6GMP级（NordmarkBiochemicals）是一种用于分离干细胞的高纯度组织解离酶。它包含具有酶活性的蛋白质，包括I类和II类胶原酶、中性蛋白酶和梭菌蛋白酶。0.4PZU/mL胶原酶NB6的最佳浓度和3h的消化时间表明，在第0代时，沃顿胶溶胶衍生的MSC产量更高。此外，其他类型的胶原酶也用于组织消化：CLSAFA（Worthington）和LiberaseMTF-SGMPGRADE（Roche）。另一方面，胰蛋白酶和胶原酶的另一种替代替代品是Accutase（Life Technologies），它是蛋白水解酶和胶原水解酶的混合物。然而，离心、过滤或微碎裂等机械作提供了避免与胶原酶使用相关的安全问题的替代方法。根据迄今为止收集的数据，来自骨髓、脂肪组织和脐带的MSC是临床试验中最常用的细胞来源。然而，AT-MSC在大规模生产中具有优势，因为与来自同一供体的BM-MSC相比，AT-MSC在长时间培养过程中具有增强的遗传和形态稳定性，并且增殖更快。此外，AT-MSCs在25次传代后表现出分化潜能降低，而BM-MSCs的免疫抑制作用仅在7次传代后观察到下降。5.临床条件下MSC的冷冻保存     细胞或组织在细胞疗法中的应用导致了治疗获得性或遗传性疾病的新型药物的诞生。这些是已知的ATMP，被定义为主要生物作用由细胞或组织执行的治疗产品。冻存保存仍然是延长细胞（包括MSC）保存时间的唯一技术。它有助于维持细胞功能特性，并允许细胞聚集以达到临床使用所需的数量。与成骨细胞和软骨细胞等特殊细胞的冷冻保存相比，MSC必须考虑更多因素。具体来说，评估MSC冷冻保存后的免疫调节和多系分化能力、细胞活力和表型至关重要。如果这些能力受损，MSC可能无法保持原有的免疫调节和再生特性。冷冻保护剂      冷冻保护剂是能够防止生物物体遭受冰冻损伤并确保其解冻后存活的试剂。冷冻保护剂在冷冻过程中的保护作用基于它们与细胞内外的水分子形成牢固键的能力，这比水分子本身之间的键更强。此外，它们还可以降低盐浓度，最大限度地降低破坏细胞蛋白质结构的风险。低温保护剂还与膜的结构部件粘合，保护它们免受冰晶的损坏（图2）。图2：细胞冻存机制作为基于细胞的疗法生产的关键步骤。在冷冻保存过程中导致细胞损伤的过程涉及特定的机制。为了防止这种伤害，必须在细胞悬液中添加适量的适当冷冻保护剂（CPA）并应用最佳冷却速率。      已经开发了各种技术来冷冻保存MSC，例如慢速冷冻和玻璃化。但是，这些方法有局限性。首先，即使使用冷冻保护剂（CPA），使用这些方法保存的MSC仍然存在冷冻损伤的风险。其次，二甲基亚砜（DMSO）等CPA可能会无意中诱导MSC分化为神经元样细胞。为了解决这些问题，需要优化CPA的使用或开发新的冻存方法。微/纳米技术的最新进展提供了有希望的改进，有可能提高冷冻保存的效率并克服当前方法的局限性。在高度疏水性的纳米粗糙表面上冷冻封装在纳升液滴中的细胞以及创建无毒的纳米级生物启发CPA等创新是该领域特别有前途的进展。     已建立的MSC冻存方案使用DMSO。残留的痕量DMSO，即使在洗涤步骤之后，也会对患者造成重大不良反应的风险。此外，DMSO与异常基因表达和MSC分化有关。因此，开发一种不含DMSO的MSC冻存方法是非常可取的。海藻糖、植物蛋白和防冻蛋白模拟物等物质已与降低浓度的DMSO相结合，以改善MSC冻存。这些组合成功地抑制了冰的再结晶，并保护了细胞膜，类似于天然防冻蛋白。目前有几种市售的冷冻保存选项用于MSC的冷冻保存。     CryoStor®CS2、CS5和CS10是市售的GMP级冻存培养基，设计用于优化细胞和组织在−80°C至−196°C的超低温环境中的保存。这些制剂在冷冻、储存和解冻过程中提供保护环境，增强细胞活力和功能，同时无需血清和高细胞毒性试剂。CryoStor专门处理细胞的分子生物学方面，减少冻存诱导的延迟性细胞死亡，从而提高解冻后活力，特别是对于MSC和肝细胞等敏感细胞类型。该产品线包括CryoStorCS2（2%DMSO）、CS5（5%DMSO）和CS10（10%DMSO）。冻存过程涉及关键步骤。最初，通过机械或酶解离制备细胞，然后离心以产生细胞沉淀。去除上清液，同时尽量减少培养基稀释。然后加入CryoStor冷培养基，使其浓度达到0.5-10×10^6个细胞/ml，在2-8°C下孵育约10分钟。以每分钟-1°C的受控速率将温度降低到-80°C，在此温度下保持15-20分钟，然后在-5°C左右开始冰成核，从而开始成核。或者，样品可以在−20°C下保存2小时，然后在−80°C下保存。冷冻后，它们可以在低于-130°C的液氮中储存，或在-80°C的温度下短期储存。解冻至关重要，应在37°C水浴中迅速解冻。解冻后，细胞-CryoStor混合物需要用培养基在20–37°C下稀释。解冻后活力应在24小时后使用活/死荧光测定或MTT等代谢测定进行评估，以仔细比较与非冷冻对照的准确性。      Ho等人提出了一项研究，其中犬AT-MSC被修饰为过表达治疗性转基因，用CryoStor10冷冻保存长达11个月。结果表明，冻存不会影响转基因表达、细胞活力或迁移能力。值得注意的是，解冻的MSC表现出与新鲜MSC相当的细胞毒性，可有效治疗患有癌症的犬患者，并导致超过20个月的无进展生存期，突出了冻存MSC在临床应用中的可行性。此外，将马MSC冷冻保存在CryoStor®CS10中，并评估其在小马体内的活力。Williams等人的研究涉及在模拟冷藏运输后和解冻后立即通过静脉注射这些MSC，并监测临床和血液学变化。结果显示没有不良反应或血液参数偏差。注射后CD4+和CD8+淋巴细胞群增加，表明可能存在免疫反应。CS10有效地维持了MSCs的活力。有必要进一步研究以探索与不同MSCs供体的免疫相互作用。      最近的一篇论文比较了两种冷冻保护剂：STEM-CELLBANKER™（CB）和10%DMSO，均在无异种成分培养基中，用于AT-MSC和BM-MSC。与非冻存MSC相比，两种冻存保护剂都保持了相似的细胞形态和表面标志物表达。然而，冷冻保存的AT-MSC与CB（90.4%）相比于DMSO（79.9%）具有更好的活力。虽然在CB和非冻存条件下，AT-MSC的群体倍增时间相当，但使用DMSO时略有增加。BM-MSC显示两种冷冻保护剂的倍增时间更长。重要的是，两种MSC类型在冷冻保存后都保留了其分化能力。总之，CB比DMSO更能保持AT-MSC的特性，这可能会影响细胞治疗应用。据制造商称，STEM-CELLBANKER®DMSOFREEGMP级是一种创新的冻存解决方案，旨在保存不含DMSO的各种细胞类型。其配方符合JPN、EU、US和PIC/S的GMP指南生产，不含血清、动物源性成分和DMSO，减轻了对研究至关重要的纯度的担忧。STEM-CELLBANKER®DMSOFree可显著提高细胞活力，同时保留细胞多能性和解冻后有效增殖等关键特性。该解决方案提供了卓越的批次间稳定性，确保了批次间性能的一致性。制造商还声称用户会喜欢它的便利性，因为它不需要准备;细胞可以直接在-80°C下冷冻，从而简化了冻存工作流程。它还在美国FDA药物主文件中注册，允许客户申请监管提交授权书。总体而言，该产品代表了那些寻求无DMSO解决方案的人在低温保存方面的重大进步。      人脐带（UC）是MSC的一个有前途的来源，尽管被归类为实体组织，但UC具有单个供体的多种用途等优势。然而，以前使用动物或同种异体血清的冻存方法导致冻融UC-MSC中的细胞增殖较低。Shimazu的研究团队使用无血清和无异种成分的冷冻保护剂STEM-CELLBANKER建立了一种最佳的冷冻保存技术。经过缓慢的冷冻过程和随后的解冻，保存的UC产生的MSC保持了与新鲜细胞相当的典型表型、免疫抑制能力和分化潜力，证明了临床活力。冻存方法和可用系统      冻存MSC有两种主要方法：慢速冷冻和快速冷冻/玻璃化。缓慢冷冻的速率为1°C/min，因其污染风险低且更易于加工而受到诊所和研究实验室的青睐，允许在一个含有低浓度CPA的小瓶中冷冻大量MSC。尽管存在冻伤风险，但优化CPA的使用对于防止冰晶形成至关重要。玻璃化反应涉及使用液氮将细胞悬液从水相快速转化为玻璃态，需要多摩尔CPA混合物和逐步引入，以尽量减少化学毒性。然而，它有渗透损伤的风险，并且由于需要人工作和高技能，不太适合大体积处理。     开发了一种新的低温保存方案，使用甜菜碱和电穿孔。甜菜碱是一种天然的渗透保护剂，稳定、无毒且高度亲水性，这使其能够竞争性地结合水分子并防止结冰。电穿孔被广泛接受用于将非渗透性分子输送到细胞中，在电刺激下在细胞膜上产生临时的疏水孔，允许分子通过。这种联合方法在各种MSC类型中表现出普遍适用性，并在各种MSC类型中保持较高的解冻后细胞活力，包括人源性UC-MSC、小鼠源性BM-MSC和转基因UC-MSC。     对于同种异体“现成”临床应用，需要大量的冷冻MSC。高细胞浓度的冻存可最大限度地减少DMSO输注量，从而降低输注相关毒性。使用CellSeal®冻存管，将1000万个/mL的细胞用5%DMSO冷冻至-80°C，并储存在液氮中。使用该系统冷冻的AT-MSC在解冻时显示出高功能活力。该系统可轻松进行床旁解冻和给药，残留DMSO极少，无需细胞洗涤。未来的研究将检查解冻后AT-MSC在体内的植入潜力。     在表3中，我们列出了用于MSC冻存的控速冷冻系统的市售选项。这些先进的冷冻系统在确保MSC在冷冻保存过程中的活力和功能方面发挥着至关重要的作用，允许受控的温度曲线，防止冰晶的形成并保持细胞完整性。该表提供了各种型号的详细信息，包括其规格、特点和典型应用，可帮助研究人员和从业人员在为其MSC冻存需求选择合适的设备时做出明智的决定。表3.用于MSC冻存的市售受控冷冻系统概述      关于MSCs悬液的冻存，必须专注于标准化细胞培养质量的评估。特别是，冷冻保存前后评估标准的一致性至关重要。通过比较冷冻前后的相似指标，我们可以准确确定冷冻保存对细胞培养的影响。此外，重要的是要认识到细胞培养物在冷冻保存后必须经过修复或驯化过程。几项研究表明，如果没有这个适应阶段，就无法完全恢复冷冻保存的干细胞的治疗潜力。     重要的是要认识到，各种复杂的基于细胞的产品可能有很大差异，这意味着单一的冻存方案可能并不适合所有产品。因此，为每个产品创建单独的协议会使标准化工作复杂化。因此，基于复杂生物医学细胞的产品的冷冻保存是一个具有挑战性和争议性的问题。然而，研究表明，这个概念是可以实现的，值得进行更深入的调查。阻碍冻存标准化的另一个方面是实验室之间技术设备的显著差异。通常，每个实验室都会根据其特定的技术能力和可用试剂来建立其冻存方案。因此，需要一种综合方法来标准化冷冻保存过程。尽管如此，编制通用指南以增强冷冻保存过程，最大限度地减少对细胞的压力应该是可行的。作者希望这篇综述有助于组织和选择冷冻保存MSCs、含MSCs的组织和相关生物医学细胞产品的方法。6.结论     当前用于生产临床级MSC的大规模扩增平台的一个局限性是不同系统和方法之间的细胞产量和质量的差异。虽然已经开发了各种生物反应器和培养容器来满足放大生产的需求，但在培养条件、细胞处理技术和质量控制措施方面仍然缺乏标准化。这种可变性会导致最终产品不一致，从而影响其治疗效果和安全性。此外，与其中一些平台相关的复杂性和成本可能会限制其广泛采用，尤其是在资源受限的环境中或小规模的生产需求中。     展望未来，应将工作重点放在标准化方案和优化大规模扩增平台上，以确保临床级MSC生产的可重复性、一致性和成本效益。这可能涉及开发更加用户友好的模块化系统，以便无缝集成到现有的制造过程中，以及实施先进的监测和控制技术，以确保对培养条件的精确调节。此外，需要继续研究新型培养基底物、培养基配方和生长因子，这些物质可以增强细胞增殖、维持干性并促进治疗效力。MSC的冷冻保存对于在临床应用中保持其活力和治疗潜力也至关重要。虽然DMSO通常用作冷冻保护剂，但它存在毒性和不必要的分化等风险，这促使开发了替代冷冻保存方法和试剂以及市售的GMP级冷冻保存培养基。此外，受控速率冷冻系统的进步提高了MSC解冻后的活力。涉及工业界、学术界和监管机构的合作倡议对于加速基于MSC的疗法从实验室到临床的转化至关重要。最终，应对这些挑战和提高大规模生产能力对于实现基于MSC的再生医学的全部潜力和满足对基于细胞的疗法日益增长的需求至关重要。识别微信二维码，添加抗体圈小编，符合条件者即可加入抗体圈微信群！请注明：姓名+研究方向！本公众号所有转载文章系出于传递更多信息之目的，且明确注明来源和作者，不希望被转载的媒体或个人可与我们联系(cbplib@163.com)，我们将立即进行删除处理。所有文章仅代表作者观点，不代表本站立场。

前言Toll样受体（TLRs）是一种先天免疫受体，直接或间接负责检测病原体相关分子模式（PAMP），并通过激活先天和适应性免疫途径对其作出反应。TLRs是抵御微生物病原体的第一道防线，TLR可以分为细胞表面和内体亚家族，识别不同的PAMP，并激活常见和特定的信号通路以形成免疫反应。尽管具有保护功能，TLR的异常反应仍会导致炎症和自身免疫性疾病。了解TLR激活和调节机制之间的微妙平衡对于破译它们在免疫防御和疾病发病机制中的双重作用至关重要。此外，天然存在和合成的TLR激动剂可以利用这些内源性免疫信号通路来增强和调节疫苗反应，从而使其成为优良的疫苗佐剂。这不仅对开发针对传染病的疫苗具有重要意义，而且对针对癌症、过敏、阿尔茨海默病和其他疾病的免疫疗法也具有重要意义。TLR的发现史1989年，Charles A. Janeway提出了一个突破性的假设，表示先天免疫系统具有通过主要在哨兵细胞上表达的受体检测微生物感染的显著能力，称之为“模式识别受体（PRRs）”。这些受体识别称为“病原体相关分子模式”的不同分子结构，这些结构在病原体中广泛表达，对其生存至关重要，但在宿主细胞中明显缺失。这使得PRRs能够有效地区分自我和非自我，并启动先天免疫反应。1996年，Hoffmann等人进行的一项研究证实了Janeway的假设。该研究表明，果蝇携带一种名为“Toll”的受体突变，由于抗真菌肽的诱导缺陷，对真菌感染表现出更高的易感性。随后，Janeway和Medzhitov的进一步探索鉴定出了Toll的人类同源物，最初称为hToll，后来被确认为Toll样受体4（TLR4）。TLR4的发现揭示了它通过激活转录因子核因子κB（NF-κB）诱导先天反应的能力，包括产生促炎细胞因子和表达共刺激分子。随后，在人类和小鼠中分别鉴定出10个和12个TLR，每个TLR都能识别多种PAMP。TLR1至TLR9在两个物种中都是保守的；由于逆转录病毒衍生的DNA插入，小鼠TLR10不起作用；TLR11、TLR12和TLR13不存在于人类基因组中。TLRs的发现推翻了人们最早的认识，即先天免疫系统识别病原体是非特异性的。TLR的结构和信号通路TLR属于I型跨膜蛋白，包括负责PAMP识别的富含亮氨酸重复序列（LRR）的外结构域、跨膜区和激活下游信号通路的细胞质Toll-IL-1受体（TIR）结构域。TLR分为细胞表面和内体亚家族：细胞表面TLR（TLR1、TLR2、TLR4和TLR5）识别脂质和蛋白质成分，而内体TLR（TLR3、TLR7、TLR8、TLR9和TLR13）专门用于核酸检测；即脂多糖（TLR4）、脂肽（TLR2与TLR6或TLR1）、鞭毛蛋白（TLR5）、单链RNA（TLR7/8）、双链RNA（TLR3）和含CpG基序的DNA（TLR9）。TLRs激活的免疫反应类型由特定TLR及其衔接蛋白激活的信号通路决定。一般来说，大多数TLR途径导致Th1免疫反应，但TLR2除外，可能由于TLR2配体的多样性，TLR2可以诱导促炎和抗炎途径，导致Th1、Th0或Th2免疫反应。除TLR3外，大多数TLR通过MyD88发挥作用。TLR激活后，MyD88募集由IL1受体相关激酶（IRAK）1、IRAK2和IRAK 4组成的寡聚复合物，并激活MyD88 TNF受体相关因子6（TRAF6）。活化的TRAF6随后触发核因子κB（NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径，从而诱导促炎细胞因子，如IL-12和TNF-α。TLR7和TLR9可以激活TRAF3磷酸化干扰素调节因子7（IRF7），从而产生IFN-α。此外，TLR3和TLR4已被证明通过其TRIF衔接蛋白募集TRAF3来诱导IFN-β的产生，从而激活IRF3。I型IFN应答可诱导强Th1细胞/细胞毒性T细胞（CTL）应答，该应答对鉴定和清除感染或癌细胞很重要。TLR2受体主要诱导以高IL-10产生和低IL-12为特征的强Th2免疫反应。TLR并不专门触发Th1或Th2途径，而是可以影响多种途径。正是信号事件的平衡决定了免疫偏向。例如，一项研究表明，TLR4和TLR2激动剂的激活可以通过p38 MAPK和ERK1/2-FOS途径刺激信号传导，分别导致IL-12或IL-10的产生；然而，TLR4在比TLR2更高的阈值下诱导p38 MAPK信号传导，而TLR2在比TLR4更高的阈下诱导ERK1/2信号传导，导致免疫极化。TLRs在适应性免疫中的作用TLRs协调了从免疫细胞迁移到增强抗体亲和力成熟的许多功能。TLRs作为危险信号传感器，增加了免疫细胞向疫苗给药部位的运输。TLR参与可增强I类和II类MHC分子的抗原捕获、处理和呈递。某些特定类型的TLR可以不同程度地影响抗原的交叉呈递，从而TLR3或TLR4，而不是TLR2或TLR7/8配体，减少CD8 +T细胞对抗原的摄取和交叉呈递。TLR激活也可导致共刺激分子（如CD80和CD86）的上调，这对APC启动幼稚T细胞至关重要。DC细胞的TLR在自我/非自我抗原识别以及是产生免疫反应还是免疫耐受中起着关键作用。不同类型的APC表达不同的TLR，例如髓系DC表达TLR2和TLR4，而浆细胞样DC（pDC）表达TRL7和TLR9。因此，TLR对不同DC谱系的优先激活可以影响随后的免疫偏向。与小鼠相比，TLR在B细胞上的表达在人类中更为有限，人类主要表达TLR 2、7、9、10，TLR2配体需要通过B细胞受体（BCR）和TLR7的交联进行额外增敏，TLR7需要1型干扰素（IFN）引发。这些TLR激动剂在体外诱导B细胞的增殖、活化和分化。最初，人们认为TLRs只促进B细胞的卵泡外反应，其特征是快速产生低亲和力抗体；然而，最近的研究表明，TLRs也可以增强生发中心反应，从而产生高亲和力抗体。TLR与BCR协同作用，诱导类转换重组和抗体反应的成熟。TLR4还增强了B细胞向引流淋巴结的迁移，并在此过程中加快了抗体类别的转换。不适宜的B细胞TLR信号传导与自身反应性B细胞和自身免疫性疾病的产生有关；因此，在疫苗配方中避免过度的TLR刺激非常重要。TLR也已被证明能增强各种不同的T细胞亚群。几项研究表明，TLRs可以作为CD8+T细胞的共刺激分子，促进细胞增殖/存活、效应器功能、细胞因子产生和记忆形成的增加。TLRs在Treg细胞中的作用仍然存在争议。几项研究表明，TLR2激动剂可诱导Treg抑制活性的暂时丧失；而其他研究表明，尽管TLR2激动剂可增加抗原特异性增殖，但Treg细胞仍保留其抑制功能。TLR在疫苗佐剂中的应用天然存在和合成的TLR激动剂可以利用这些内源性免疫信号通路来增强和调节疫苗反应，从而使其成为优良的疫苗佐剂。疫苗配方中使用的TLR激动剂有多种形式，从脂肽到单链DNA和RNA。下面介绍TLR佐剂的主要类别。TLR2TLR2在多种细胞表面表达，包括单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞、上皮细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞、髓系抑制细胞、血小板和肥大细胞。TLR2识别的PAMP库是最广泛的，因为它能够与TLR1和TLR6（以及人类中的TLR10）形成异二聚体。TLR2佐剂的范围很广，包括合成脂肽（PAM3CSK4和PAM2CSK4）、阿拉伯甘露糖脂、脂磷壁酸、GPI膜锚定物、酵母多糖和肽聚糖。近年来TLR2研究的主要趋势包括发现小型合成TLR2激动剂、改进传统TLR2激动物的特性以及TLR2与疫苗抗原的生物偶联。例如，XS15（PAM3CS-GDPKHPKSF）是一种新的基于PAM3CS的TLR-1/2激动剂，其中PAM3CSK4的四赖氨酸（K4）被九肽（GDPKHPKSF）取代，以改变偶联物的水溶性，不仅促进摄取，而且易于纯化。使用TLR2激动剂作为佐剂的局限性包括大多数配体的大小、复杂性和疏水性。TLR3TLR3是一种细胞内识别系统，对病毒核酸（dsRNA、ssRNA和ssDNA）以及内源性双链RNA作出反应。已经开发了许多TLR3激动剂，如RGC100和ARNAX，一种合成的DNA-RNA杂交化合物。然而，在过去两年中，研究人员又回到了使用传统的dsRNA模拟配体，如poly IC，重点是改进其递送模式和新的疾病应用。TLR4TLR4是TLR家族中研究最多的成员，它识别脂多糖（LPS）。TLR4位于质膜上，主要在髓系细胞上表达，而pDCs和幼稚B细胞不表达。TLR4通过其共受体骨髓分化因子-2（MD-2）和CD14识别LPS。最近关于TLR4激动剂的工作集中在修饰产物的开发和评估上，如单磷酸脂质A（MPLA）和吡喃葡萄糖脂质A（GLA），它们在结构上与LPS相关，但没有高致热原性并保持强免疫增强特性，从而增加了其临床应用的可行性。TLR5TLR5识别鞭毛蛋白，并在上皮细胞和免疫细胞（如巨噬细胞和未成熟DC）上表达，通过MyD88依赖性信号通路产生免疫反应。最近关于TLR5激动剂的工作主要集中在提高耐受性上。不幸的是，鞭毛蛋白会诱导不必要的过度反应原性，作为一种蛋白质，它可以诱导针对自身的抗体，干扰其作为佐剂的功能。有研究通过从鞭毛蛋白中去除B细胞表位区域解决了这一问题，脱免疫的鞭毛蛋白保留了其TLR5佐剂活性。TLR7/8TLR7和TLR8位于免疫细胞的内涵体膜上。TLR7主要在pDC和B细胞中表达，而TLR8在髓系树突状细胞、单核细胞中表达，在pDC中表达程度较低。TLR7/8识别单链核糖核酸（ssRNA），并通过MyD88依赖性途径发出信号。在天然配体中，富含腺苷和尿苷的寡核苷酸（ORN）能够激活TLR8，而对TLR7没有任何影响，而富含鸟苷的ORN激活TLR7和TLR8依赖性信号传导。TLR7以单体形式存在，并在配体存在下二聚，而TLR8以天然存在的弱二聚体存在，在配体结合时发生构象变化。目前已发现15种以上的新型杂环分子，如咪唑喹啉、蝶呤、嘧啶、吡啶嘧啶、吡咯嘧啶和苯并咪唑，被鉴定为TLR7/8激动剂。TLR7/8激动剂的一个常见缺点是反应原性，近年来，有大量研究试图克服这些副作用。将TLR7/8激动剂封装在基于阳离子DOEPC的脂质体制剂纳米颗粒中，或将这些小分子共价连接到超支化聚合物上，可以避免其有害的系统反应，同时保持其对体液免疫的影响。TLR9TLR9在细胞内定位于内涵体膜中，识别细菌和病毒DNA的单链非甲基化CpG寡核苷酸。TLR9在免疫细胞上表达，如树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和其他APC。合成CpG序列可用作TLR9激动剂，以增强疫苗的免疫反应，并且每种独特的序列变异组合已被证明具有不同的结构和生物学特性。TLR9激动剂在过去两年中的最新发展主要集中在CpG向细胞的有效递送和摄取上。例如，一项研究介绍了一种将CpG-ODN偶联到新型阳离子脂质体上的新方法，该复合物能够在低抗原和佐剂剂量下诱导强烈的免疫反应。组合TLR佐剂将不同TLR的激动剂组合在单一疫苗中产生协同效应，可以驱动强大的疫苗免疫反应。例如，包含1V270（TLR7激动剂）和2B182C（TLR4激动剂）的脂质体佐剂诱导了针对流感的平衡的抗HA和抗NA IgG1和IgG2a反应，而没有Th1促炎反应常见的过度反应原性。类似地，一项研究评估了卵清蛋白（OVA）与两到三种TLR配体的十种独特组合的共包封，包括Pam3CSK4（TLR2激动剂）、MPLA（TLR4激动剂），咪喹莫特（TLR7/8激动剂）和CpG（TLR9激动剂），而三重组合以总体平衡的Th1/Th2应答促进抗原特异性抗体滴度。因此，TLR佐剂的组合可以提供广泛的定制免疫反应。TLR激动剂与其他PAMP如NOD2和巨噬细胞诱导型Ca²的组合⁺-依赖性凝集素受体（Mincle）配体也很有前景。共价连接CL239（TLR7激动剂）和胞壁酰二肽（NOD2激动剂），并将双激动剂作为纳米颗粒与NP-p24 HIV疫苗结合，协同作用增强了对小鼠的保护。小结TLR的发现大大增强了我们对先天免疫反应分子机制的理解，为创新的治疗方法和疫苗开发奠定了基础。靶向TLR的合成激动剂已被证明是非常有利的佐剂，相反，TLR拮抗剂对于减轻过度免疫反应具有重要价值，从而有助于治疗以TLR异常激活为特征的自身免疫性疾病。然而，关于单个TLR的特异性以及与其他PRR的潜在冗余问题仍然存在。微生物核酸被内体TLR和细胞质PRR识别，这确保了先天免疫系统能够通过不同细胞隔室中的多个PRR对各种病原体做出有效反应。TLR和PRR之间的相互作用是强有力地诱导免疫反应所必需的，这些PRR的激动剂的组合通过激活DC协同增强佐剂疗效。鉴于微生物病原体含有多种PAMP，这种协同作用可能在感染过程中自然发生，这可能解释了为什么与疫苗接种相比，自然感染通常会诱导更强的适应性免疫反应。然而，这种协同作用也可能与炎症性疾病的加重有关。因此，了解TLR和其他PRR之间的协同作用和相互作用机制对于开发先进的疫苗佐剂以及控制TLR相关疾病的药物至关重要。参考文献：1.Toll-like receptor (TLR) agonists as a driving force behind next-generation vaccine adjuvants and cancer therapeutics. Curr Opin Chem Biol.2022 Oct;70:1021722. Decoding Toll-like receptors: Recent insights and perspectives in innate immunity. Immunity.2024 Apr 9;57(4):649-673.推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。©2021 医药速览 保留所有权利往期链接“小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点 人人学懂免疫学| 人人学懂免疫学（语音版）   综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普|医药前沿笔记PROTAC技术| 抗体药物| 抗体药物偶联-ADC核酸疫苗 | CAR技术| 化学生物学温馨提示医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送①点击标题下方“医药速览”  ②至右上角“...”  ③点击“设为星标

前言 免疫检查点抑制剂是癌症免疫治疗研究的一个重要里程碑。PD-1/PD-L1和CTLA-4抑制剂已成功获得监管部门批准，用于多种癌症类型的治疗。然而，依然有一些原发性或适应性耐药患者可能无法从肿瘤免疫治疗的整体治疗潜力中获益。因此，探索新的免疫检查点抑制剂的可用性变得越来越重要。 一种新兴的共抑制受体CD112R（PVRIG）常见于自然杀伤细胞（NK）和T细胞上表达。它与配体（CD112或PVRL2/nectin-2）结合，抑制T细胞和NK细胞对肿瘤细胞的反应强度。因此，CD112R被认为是一种新型的免疫检查点，在肿瘤免疫治疗中具有很高的潜力。CD112的高水平表达与大多数癌症患者的肿瘤进展和不良预后有关。目前，CD112R的抑制剂已经在癌症患者的临床试验中得到验证，CD112R可能是一个非常有前景的靶点。 CD112R的结构与表达 CD112R是属于脊髓灰质炎病毒受体（PVR）家族的共抑制受体，最初被称为PVR相关Ig结构域（PVRIG）。在人类，CD112R为一个36kD的单次跨膜蛋白，包含一个跨膜区、一个长的细胞内结构域和一个细胞外免疫球蛋白可变样（IgV）结构域。 在正常人外周血细胞中，CD112R基因在NK和T淋巴细胞中表达，但在单核细胞衍生的树突状细胞（DC）、中性粒细胞（CD66b+）、单核细胞（CD14+）和B细胞（CD19+）中不表达。大多数表达CD112R的T细胞是CD8+T细胞，主要是效应/记忆细胞。值得注意的是，CD8+和CD4+T细胞的激活会进一步上调了CD112R的表达。 CD112R表达发生在各种类型实体瘤的NK细胞、CD8+T细胞和CD4+T细胞中。高水平表达常出现在肾脏、卵巢、肺、前列腺和子宫内膜的肿瘤中。同样，CD112R在急性髓系白血病的T细胞和NK细胞中表达。 此外，CD112R表达与CD8+和CD4+TIL上的PD-1和TIGIT表达同时出现，这与耗竭的T细胞表型显著相关。此外，CD112R的表达也与NK细胞上的耗竭标记物的表达相伴，包括CD96、TIGIT、Tim-3和PD-1。 CD112的结构与表达 CD112也称为连接蛋白-2或PVR相关蛋白2（PVRL2），是连接蛋白家族的成员，与肿瘤血管生成、生长和转移相关。CD112包括一个具有三个Ig样结构域（两个IgC和一个远端IgV结构域）的胞外区域、一个细胞质尾部和一个跨膜区域。细胞质尾部有一个保守的afadin结合基序（Glu/Ala-X-Tyr-Val），可以与PDZ结构域结合，从而帮助连接蛋白连接到F-肌动蛋白。 研究表明，CD112主要定位于上皮细胞的粘附连接处，并在各种细胞中广泛表达，包括上皮细胞、内皮细胞、神经元和成纤维细胞。此外，CD112也出现在癌细胞和免疫细胞中，如单核细胞和DC细胞。 CD112/CD155共抑制网络 在共抑制途径中，PVR和PVR样家族的成员，包括CD112R、TIGIT、CD96、CD155、CD226和CD112，形成一个复杂的信号网络调节T细胞的激活。 网络中的配体可以通过与不同受体结合来调节淋巴细胞的活性，CD155可以与CD226、TIGIT和CD96相互作用，而CD112与CD226、TIGIT和CD112R相互作用。而它们之间的亲和力也截然不同。 不同的抑制性和共刺激性检查点受体可以相互调节。当CD8+T细胞被特异性抗原激活时，观察到CD112R与TIGIT的共表达。CD112R阻断可导致TIGIT的诱导表达，而阻断TIGIT或PD-1后，未观察到CD112R表达的变化。由于CD226和CD112R在CD112上有相同的结合位点，CD226与抑制性免疫检查点CD112R竞争结合CD112，以促进T细胞活化。因此，CD112R可显著抑制T细胞中CD112–CD226的相互作用。 在各种癌症中，TIGIT的表达与TIL上PD-1的表达同时显著增加。与健康人相比，癌症患者的TIGIT水平更高，CD226水平更低。一些抑制性受体，包括TIGIT、Tim-3、PD-1和LAG-3，与野生型小鼠的CD8+T细胞相比，在CD112R−/−的小鼠浸润CD8+T细胞上高表达。因此，CD112R与其他免疫受体及其相关配体之间的竞争或协同调节控制肿瘤微环境中的免疫细胞浸润和激活。 CD112R/CD112轴在肿瘤治疗中的作用 在人类中，CD112R的表达发生在多种肿瘤的T细胞和NK细胞上。已知CD112R/CD112轴阻碍T细胞的免疫功能。与癌症免疫治疗中众所周知的PD-1/PD-L1通路一样，新型的CD112R/CD112通路可能很快在肿瘤免疫治疗方面发挥作用。 CD112R-CD112通路在调节T细胞杀死肿瘤细胞的过程中起着至关重要的作用。研究发现，在黑色素瘤和结肠癌的CD112R缺陷小鼠模型中，肿瘤生长停止，肿瘤免疫细胞浸润增加，尤其是CD8+T细胞。此外，在结肠癌模型中，发现抗CD112R阻断抗体单独或与PD-L1抑制剂联合使用可改善抗肿瘤效果并抑制难治性肿瘤进展。 此外，阻断CD112R有助于NK细胞的抗肿瘤功效并抑制肿瘤生长。在体外，CD112R或TIGIT阻断剂可增加与乳腺癌细胞共培养的IFN-γ+NK细胞的数量。CD112R和TIGIT单克隆抗体联合使用可诱导IFN-γ+NK细胞的额外增加，并提高NK细胞的细胞毒性。CD112R阻断能有效抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的生存期，这与肿瘤浸润NK细胞的频率和细胞毒性潜能的增强有关。 COM701是一种针对PVRIG的“first-in-class”的单克隆抗体，正在对标准治疗无效的晚期或转移性实体恶性肿瘤患者中进行一期临床试验（NCT03667716）。近期结果显示，28例患者（16例单药治疗，12例与nivolumab联合治疗）的疾病控制率（DCR）为57%（16/28），没有CRs。在接受治疗超过15周的原发性腹膜癌患者中，单药治疗组有1例确诊PR。在联合治疗组中，另有1名患者获得了未经证实的PR，治疗超过34周。没有DLT报告，最常见的不良事件是1级和2级疲劳、皮疹、水肿和恶心。初步结果表明，这种疗法具有潜在益且没有明显的副作用。它不仅可以作为一种辅助治疗，还可以成为一种可行的替代性单独治疗。 小结 已有的数据表明，CD112R-CD112轴在调节T细胞和NK细胞肿瘤杀伤能力方面具有重要的作用。靶向CD112R/CD112轴在癌症免疫治疗中表现出极具前景的应用。临床结果表明，CD112R阻断剂不仅可以作为一种辅助治疗，还可能成为一种可行的替代性单独治疗。随着对CD112R/CD112介导的免疫反应调节研究的深入，将有助于针对癌症患者进行CD112R阻断剂的优化组合策略设计，为更多的癌症患者带来益处。 参考文献： 1.The CD112R/CD112 axis: a breakthrough in cancer immunotherapy. JExp Clin Cancer Res. 2021; 40: 285. 2. Hitting the complexity of the TIGIT-CD96-CD112R-CD226 axis fornext-generation cancer immunotherapy. BMB Rep. 2021 Jan 31; 54(1): 2–11. 推文用于传递知识，如因版权等有疑问，请于本文刊发30日内联系医药速览。 原创内容未经授权，禁止转载至其他平台。 有问题可发邮件至yong_wang@pku.edu.cn获取更多信息。 ©2021 医药速览 保留所有权利 往期链接 “小小疫苗”养成记 | 医药公司管线盘点  人人学懂免疫学 | 人人学懂免疫学（语音版）    综述文章解读 | 文献略读 | 医学科普 | 医药前沿笔记 PROTAC技术 | 抗体药物 | 抗体药物偶联-ADC 核酸疫苗 | CAR技术 | 化学生物学 温馨提示 医药速览公众号目前已经有近12个交流群（好学，有趣且奔波于医药圈人才聚集于此）。进群加作者微信（yiyaoxueshu666）或者扫描公众号二维码添加作者，备注“姓名/昵称-企业/高校-具体研究领域/专业”，此群仅为科研交流群，非诚勿扰。 简单操作即可星标⭐️医药速览，第一时间收到我们的推送 ①点击标题下方“医药速览”   ②至右上角“...”  ③点击“设为星标